余文杰 沈孝坤.浙江省臺(tái)州醫(yī)院腫瘤外科，浙江臨海 37000；.浙江省臺(tái)州醫(yī)院腫瘤科，浙江臨海 37000

膜聯(lián)蛋白Ⅱ在乳腺癌組織中的表達(dá)以及對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響

余文杰1沈孝坤2
1.浙江省臺(tái)州醫(yī)院腫瘤外科，浙江臨海 317000；2.浙江省臺(tái)州醫(yī)院腫瘤科，浙江臨海 317000

目的探討膜聯(lián)蛋白Ⅱ在乳腺癌中的表達(dá)以及對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響。 方法分別采用免疫組化方法檢測(cè)AnnexinⅡ蛋白在正常乳腺組織、導(dǎo)管原位癌以及侵襲性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)情況，并測(cè)定高侵襲性乳腺癌細(xì)胞株及低侵襲性乳腺癌細(xì)胞株中AnnexinⅡ mRNA（RT-PCR法）以及蛋白（蛋白印記技術(shù)）的表達(dá)情況。結(jié)果AnnexinⅡ在正常乳腺組織中主要表達(dá)在間質(zhì)內(nèi)，在乳腺導(dǎo)管上不表達(dá)，在導(dǎo)管原位癌以及侵襲性導(dǎo)管癌組織中間質(zhì)、血管、腫瘤組織上均有表達(dá)。AnnexinⅡ在正常乳腺組織表達(dá)的IOD值為（6.5±1.0）×106，在導(dǎo)管原位癌中表達(dá)的IOD值為（27.5±3.0）×106，在侵襲性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)的IOD值為（40.0±11.0）×106。三組間比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），導(dǎo)管原位癌、侵襲性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常乳腺組織，而侵襲性導(dǎo)管癌中的表達(dá)量顯著高于導(dǎo)管原位癌（均P＜0.01）。AnnexinⅡmRNA在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s中的表達(dá)灰度值（0.83±0.11）顯著高于MCF-7株中的表達(dá)（0.07±0.01），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；AnnexinⅡ蛋白在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s中的表達(dá)（1.47±0.08）顯著高于MCF-7株中的表達(dá)（0.11± 0.03），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 結(jié)論AnnexinⅡ在乳腺癌中高表達(dá)，并且瘤細(xì)胞侵襲性越強(qiáng)，其表達(dá)也越強(qiáng)。

乳腺癌；增殖；膜聯(lián)蛋白Ⅱ

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，近年來乳腺癌的發(fā)病率有上升的趨勢(shì)。膜聯(lián)蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）是一種磷脂結(jié)合蛋白，具有鈣離子依賴性，主要以單體、二聚體和四聚體的形式存在，四聚體是2個(gè)AnnexinⅡ蛋白單體與2個(gè)s100A10（P11）單體組成［1-3］。AnnexinⅡ和s100A10組成的四聚體只存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，而細(xì)胞核中AnnexinⅡ以單體形式存在。AnnexinⅡ參與細(xì)胞的分泌、增殖、細(xì)胞骨架連接等生物學(xué)功能，還能直接結(jié)合到原癌基因（c-myc）mRNA上，上調(diào)c-Myc蛋白［4-6］。研究顯示AnnexinⅡ在多種腫瘤中有過表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用［7-8］。本研究通過比較正常乳腺組織、導(dǎo)管原位癌以及侵襲性導(dǎo)管癌中AnnexinⅡ水平，分析AnnexinⅡ在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，通過比較高侵襲性乳腺癌細(xì)胞株及低侵襲性乳腺癌細(xì)胞株中AnnexinⅡ的表達(dá)情況，分析AnnexinⅡ在乳腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的作用。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本及細(xì)胞株

正常乳腺組織以及乳腺癌組織均由浙江省臺(tái)州醫(yī)院病理室提供。人乳腺癌細(xì)胞株包括高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s株和低侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，購自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

小鼠抗人AnnexinⅡ單克隆抗體，小鼠抗人β-actin單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗上樣IgG，由美國Santa Cruz公司提供；辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，辣根過氧化酶標(biāo)記的兔抗羊IgG，TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，SP免疫組化試劑盒，由上海鑫樂生物科技有限公司提供。細(xì)胞培養(yǎng)箱，雙垂直板蛋白電泳槽，電泳儀，凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 AnnexinⅡ在正常乳腺組織、乳腺癌組織中的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)本脫蠟，加入3%H2O2浸泡，去除內(nèi)源性過氧化氫酶，清水沖洗2次，加入0.01 mol/L的檸檬酸，蒸煮3 min，冷卻后再蒸煮1次，冷卻，抗原修復(fù)。水洗2次后將載玻片放置于PBS液中5 min洗2次，擦干，加正常山羊/兔血清封閉，37℃溫箱中放置30 min。加一抗，4℃保存過夜，置于37℃下復(fù)溫后在PBS液中沖洗5 min，3次，加二抗，37℃溫箱中放置20 min。PBS沖洗5 min，3次，加SABC，37℃溫箱內(nèi)放置30 min。PBS液沖洗5 min，3次，加DAB顯色液。清水沖洗后浸泡入蘇木精復(fù)染1 min。脫水，封片。在顯微鏡下觀察圖像，并采用軟件分析染成黃色區(qū)域的累積光密度（IOD）值。

1.3.2 AnnexinⅡmRNA以及蛋白在高侵襲人乳腺癌細(xì)胞株以及低侵襲人乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá) MDAMB-435s以及MCF-7細(xì)胞株接種于培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用RT-PCR方法測(cè)定AnnexinⅡmRNA的表達(dá)情況。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。提取乳腺癌細(xì)胞的總RNA，所得RNA行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)，50 μL體系，預(yù)變性94℃2 min，變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃35 s，延伸72℃5 min。其中變性-退火-延伸循環(huán)28次。凝膠電泳成像，分析灰度值。采用Western blot測(cè)定人乳腺癌細(xì)胞中AnnexinⅡ蛋白的表達(dá)。提取總蛋白，測(cè)定蛋白含量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，分別加一抗、二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，顯色，采用Quantity One凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶的光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AnnexinⅡ在正常乳腺組織、導(dǎo)管原位癌、侵襲性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)

AnnexinⅡ在正常乳腺組織中主要表達(dá)在間質(zhì)內(nèi)，在乳腺導(dǎo)管上不表達(dá)，在導(dǎo)管原位癌以及侵襲性導(dǎo)管癌組織中在間質(zhì)、血管、腫瘤組織上均有表達(dá)。AnnexinⅡ在正常乳腺組織表達(dá)的IOD值為（6.5±1.0）×106，在導(dǎo)管原位癌中表達(dá)的IOD值為 （27.5±3.0）×106，在侵襲性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)的IOD值為（40.0±11.0）×106。三組間比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），導(dǎo)管原位癌、侵襲性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常乳腺組織，而侵襲性導(dǎo)管癌中的表達(dá)量顯著高于導(dǎo)管原位癌（均P＜0.01）。見圖1～4。

2.2 AnnexinⅡmRNA及蛋白在不同人乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)

AnnexinⅡmRNA在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s中的表達(dá)顯著高于MCF-7株中的表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；AnnexinⅡ蛋白在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s中的表達(dá)顯著高于MCF-7株中的表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

3 討論

AnnexinⅡ是一種依賴鈣離子的磷脂結(jié)合蛋白，又名P36、ANX2、LIP2、LPC2、CAL1H、LPC2D、ANX2L4、PAP-IV。其基因位于15q21-q22，蛋白分子量為36 kD，在人體內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)豐富。以單體、二聚體以及四聚體方式存在，不同的形式生物學(xué)功能不同。人AnnexinⅡ的結(jié)構(gòu)基因位于15q21-q22，含1.4 kb編碼基因，并有3個(gè)假基因分別位于4號(hào)、9號(hào)、10號(hào)染色體上。人AnnexinⅡ結(jié)構(gòu)基因含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子。AnnexinⅡ由339個(gè)氨基酸殘基組成，是Annexins家族A亞家族成員。與該家族其他成員一樣，它在結(jié)構(gòu)上都具有一個(gè)保守的羧基末端和一個(gè)可變的氨基末端。保守的羧基末端一般具有4個(gè)Annexin重復(fù)子，每一個(gè)重復(fù)子由大約70個(gè)高度保守氨基酸殘基構(gòu)成。每一個(gè)重復(fù)子有5個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，它們堆疊成致密的圓盤狀。該結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合鈣離子的能力，從而調(diào)節(jié)Annexin分子與磷脂分子的結(jié)合，故被稱為所有Annexins家族成員的核心區(qū)域，被鈣離子活化后可與膜磷脂結(jié)合的蛋白，參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜表面其他一系列依賴于鈣調(diào)蛋白的活動(dòng)。

AnnexinⅡ除了在細(xì)胞分泌、增殖、細(xì)胞骨架連接、纖溶等方面發(fā)揮重要的作用外，其還具有結(jié)合RNA的作用，結(jié)合到c-mycmRNA上，可上調(diào)c-Myc蛋白。越來越多的研究顯示，AnnexinⅡ在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。孟鑫等［9］研究顯示AnnexinⅡ在胃癌中高表達(dá)。陳輝等［10］研究顯示AnnexinⅡ可能參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生和發(fā)展。AnnexinⅡ四聚體在腫瘤的遷移過程中充當(dāng)了組織型纖溶酶原活化劑、纖溶酶原的受體，產(chǎn)生活化的纖溶酶，活化基質(zhì)金屬蛋白酶，從而參與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程［11-13］。

本研究對(duì)正常乳腺組織、乳腺癌組織中AnnexinⅡ的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示AnnexinⅡ在正常乳腺組織內(nèi)僅僅表達(dá)在組織間質(zhì)，在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)，但是在乳腺癌的上皮細(xì)胞胞質(zhì)以及胞膜內(nèi)均呈現(xiàn)高表達(dá)，并且在乳腺癌組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞上也出現(xiàn)高表達(dá)。通過IOD進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，AnnexinⅡ在侵襲性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)最高，在導(dǎo)管原位癌組織中的表達(dá)其次，在正常乳腺組織中的表達(dá)最低。提示AnnexinⅡ可能與乳腺癌的侵襲有關(guān)。為了進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，分別選擇了高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s以及低侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7進(jìn)行研究，分析不同侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株中AnnexinⅡmRNA以及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435s株中AnnexinⅡmRNA以及蛋白的表達(dá)均顯著高于低侵襲性人乳腺癌細(xì)胞MCF-7株。這進(jìn)一步證實(shí)AnnexinⅡ可能與乳腺癌腫瘤細(xì)胞的侵襲性相關(guān)。

既往的定位研究顯示，AnnexinⅡ在細(xì)胞內(nèi)的分布廣泛，不僅存在于細(xì)胞漿內(nèi)，還存在于細(xì)胞核［14-15］。細(xì)胞漿內(nèi)的兩個(gè)AnnexinⅡ與2個(gè)s100A10形成四聚體，借助AnnexinⅡ的親鈣特性以及磷脂性轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，從而發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。AnnexinⅡ可調(diào)節(jié)s100A10水平，并且能夠屏蔽細(xì)胞內(nèi)s100A10的泛素化信號(hào)，從而穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)s100A10蛋白水平。另外單體或者四聚體的AnnexinⅡ均能夠結(jié)合F-肌動(dòng)蛋白，發(fā)揮穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用［16-17］。AnnexinⅡ還是一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因，AnnexinⅡ單體可作為蛋白復(fù)合物的一部分，發(fā)揮增強(qiáng)DNA聚合酶α活性的作用，促進(jìn)合成DNA［15］。AnnexinⅡ蛋白還可作為RNA結(jié)合蛋白，結(jié)合PolyG以及c-myc基因的mRNA上，形成mRNP，發(fā)揮調(diào)節(jié)c-myc基因mRNA翻譯的作用，而c-Myc蛋白參與了細(xì)胞的增殖、代謝、更新、分化、凋亡［18］。丁滔等［19］研究顯示，AnnexinⅡ在不同Gleason評(píng)分、前列腺特異性抗原水平、臨床分期、不同危險(xiǎn)度中的表達(dá)存在顯著差異，認(rèn)為AnnexinⅡ表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，AnnexinⅡ在乳腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且隨著腫瘤細(xì)胞侵襲性的增強(qiáng)，其表達(dá)水平也顯著升高。提示其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮了重要的作用。本次研究并沒研究AnnexinⅡ在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲過程中發(fā)揮作用的具體機(jī)制，期望在今后的工作中能夠進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。

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Expression of AnnexinⅡin breast cancer and the effects on the invasion of breast cancer cells

YU Wenjie1SHEN Xiaokun2
1.Department of Oncological Surgery,Taizhou Hospital of Zhejiang Province,Linhai 317000,China;2.Department of Oncology,Taizhou Hospital of Zhejiang Province,Linhai317000,China

ObjectiveTo discuss expression of AnnexinⅡ in breast cancer and the effects on the invasion of breast cancer cells.Methods AnnexinⅡ expression in normal breast tissue,ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma tissues were detected by immunohistochemical method,and AnnexinⅡ mRNA (RT-PCR)and protein (Western blot)expressions in high invasive breast cancer cell lines and low invasive breast cancer cell lines were detected.Results In normal breast tissue,AnnexinⅡ was mainly detected in troma,without expression on breast catheter.In ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma tissues,AnnexinⅡ was detected in troma,vessel and tumor tissue.IOD of AnnexinⅡ expression in normal breast tissue was (6.5±1.0)×106,in ductal carcinoma was (27.5±3.0)×106,and in invasive ductal carcinoma tissues was(40.0±11.0)×106.There was significant difference in three groups(P＜0.01).IOD of AnnexinⅡexpression in invasive ductal carcinoma tissues and ductal carcinoma was higher than that in normal breast tissue,and IOD of AnnexinⅡ expression in invasive ductal carcinoma tissues was higher than that in ductal carcinoma(all P＜0.01).Gray value of AnnexinⅡmRNA expression in high invasive breast cancer cell lines MDA-MB-435s was (0.83±0.11),which was higher than that in low invasive breast cancer cell lines MCF-7 (0.07±0.01),and there was significant difference between two cell lines(P＜0.01).IOD of AnnexinⅡprotein expression in high invasive breast cancer cell lines MDA-MB-435s was (1.47±0.08),which was higher than that in low invasive breast cancer cell lines MCF-7(0.11±0.03),and there was significant difference between two cell lines(P＜0.01).Conclusion AnnexinⅡshows high expression in breast cancer,and the stronger aggressive of tumor cells is,the higher expression of it is.

Breast cancer;Multiplication;AnnexinⅡ

R737.9

A

1673-7210(2015)01(b)-0004-04

2014-10-10本文編輯：張瑜杰）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)81202103）。