閆瑩瑩，婁季宇，白宏英，楊霄鵬，焦義明，樂 婷，劉海燕

腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是Burmester 等［1］發(fā)現(xiàn)的主要表達于神經系統(tǒng)的第三類攜氧珠蛋白，與氧有很高的親和力，促進氧傳遞到線粒體，提高腦組織氧利用率。NGB 減少氧化應激誘導的ROS/RNS 過表達和脂質過氧化作用，抑制線粒體功能障礙、凋亡及細胞死亡［2］。降低NGB 表達會增加組織和細胞缺氧損傷程度，缺血/缺氧可啟動NGB 對神經細胞的保護，從而為治療腦卒中的候選藥物。丁苯酞(NBP)具有明確抗腦缺血作用，但其具體的機制未完全明了。本文旨在研究NBP 是否調節(jié)腦缺血大鼠NGB 表達，減少氧化應激損傷，從而為NBP治療腦梗死患者提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SD 大鼠90只，體重280g～350 g，購自河南省實驗動物中心(合格證號SCXK(豫)2010-0002)。隨機分為假手術組、模型組、治療組。每組按術后處死時間分為3 個亞組:1 d、3 d 和7 d，每亞組10 只。

1.2 藥物和主要試劑 NBP 原料藥由石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司提供，批號518120502。以植物油制成濃度為32 mg/ml 溶劑用于動物灌胃。RT-PCR 試劑盒和Trizol 購自Transgen 公司，引物購自北京博大泰克公司;NGB 單克隆兔抗鼠抗體購自美國Sigma 公司;SOD、MDA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。圖像采集使用德國Lecia 顯微照像系統(tǒng)，圖像分析系統(tǒng)為上海山富科學儀器有限公司(Biosens Digital Imaging System v1.6)。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法 治療組于術后2 h 按80 mg/kg 丁苯酞植物油灌胃，假手術組和模型組予等量植物油灌胃，每天2 次。

1.3.2 實驗動物模型建立 10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射(ip)麻醉，仰臥位固定，頸部備皮，消毒，頸部正中切口，鈍性分離各層組織，分離左側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)，結扎ECA 遠心端，動脈夾夾閉CCA 及ICA，剪斷ECA，沿ECA 殘端向ICA 插入魚線，進入長度約18 mm±0.5 mm 時，可感阻力，停止插線，ECA 殘端結扎并固定魚線。清理切口，逐層縫合。術后60W 白熾燈直接照射保持肛溫37 ℃。假手術組只分離，不結扎，不插線。

采用Longa 等［3］制定的5 級神經功能缺損評分法對腦梗死大鼠術后3 h 和各時間點處死前行行為學評分。1 分以上為模型制作成功，選擇評分在1～3 分大鼠為實驗對象，剔除神經損傷太重或無損傷大鼠并予以補充。

1.3.3 標本采集及保存 每組大鼠于相應時間點處死，隨機取5 只心臟灌注4%多聚甲醛后取腦，4%多聚甲醛固定24 h 后石蠟包埋保存。其余5只斷頭新鮮取腦，液氮迅速冷凍后移于-80℃冰箱保存。

1.3.4 RT-PCR 檢測 NGB mRNA Trizol 一步法提取腦組織總RNA，用紫外分光光度計定量，取少量用于RNA 含量及純度測定。總RNA 先用RNase H 處理后，用RT-PCR 試劑盒進行cDNA 的合成及PCR 反應。通過大鼠NGB cDNA 序列設計引物，如下:上游:5’-CCGCAGCCCTCTGGAACAT-3’;下游:5’-TGTAGAGCAGGGACTCACCTA-3’;擴增產物長度296 bp。以GAPDH 為內參照，引物序列為上游:5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’;下游:5’-TGATGGCATGGACTGTGG-3’;擴增產物長度506 bp。PCR 反應條件:94 ℃預變性2 min，一個循環(huán);94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)，72 ℃總延伸6 min。PCR 擴增目的產物進行電泳并對目的條帶用凝膠分析系統(tǒng)進行分析，對目的條帶與內參GAPDH 的DNA 條帶灰度值的比值進行相對含量計算。

1.3.5 免疫組化法檢測NGB 表達 大鼠腦組織石蠟切片5 μm，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，PBS洗3 次，高壓抗原修復5 min，自然冷卻，PBS 沖洗3次，用二抗同源血清進行封閉，甩掉血清，滴加一抗50 μl，室溫下孵育1 h;滴加二抗50 μl 室溫孵育15 min，DBA 顯色，蘇木素復染，脫水，透明及封片。100 倍鏡下觀察，400 倍鏡下計數(shù)陽性細胞數(shù)，同時采用圖像分析系統(tǒng)進行分析。

1.3.6 化學比色法檢測SOD 活性和MDA 含量 將新鮮腦組織用磷酸鹽漂洗3 次，除去血液、濾紙拭干，精確稱重后制備10%勻漿，3000 r/min 離心15 min，取上清液按測試盒說明書進行SOD 活性和MDA 含量檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 進行數(shù)據錄入和處理，計量資料用 表示，多組間多時間點比較采用析因方差分析，進一步分析分組單獨效應，方差齊時兩兩比較采用LSD 法，方差不齊時采用Dunnett’s T3 法，兩獨立樣本比較采用t 檢驗，檢驗水準=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 神經功能缺損評分 除術后3 h 外，治療組神經功能評分均低于模型組;不同時間點之間兩組神經功能評分差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，術后3 h 評分開始增加，1 d 達峰，隨后逐漸下降;分組和時間之間存在交互效應(P＜0.05)(見表1)。

2.2 NGB mRNA 表達 不同組間NGB mRNA差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，模型組較假手術組高，治療組較模型組高;不同時間點間NGB mRNA差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，假手術組各時間點NGB mRNA 差異不明顯，模型組和治療組NGB mRNA 表達隨時間延長逐漸降低;分組和時間之間存在交互效應(P＜0.05)(見表2、圖1)。

2.3 NGB 蛋白表達 不同組間NGB 差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，模型組較假手術組高，治療組較模型組高;不同時間點間NGB 差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，假手術組各時間點NGB 差異不明顯，模型組和治療組NGB 表達隨時間延長逐漸下降;分組和時間之間存在交互效應(P＜0.05)(見表3)。

2.4 SOD 活性、MDA 含量檢測 不同組間SOD 活性和MDA 含量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，SOD 活性模型組較假手術組低，治療組較模型組高、較假手術組低;MDA 含量模型組較假手術組高，治療組較模型組低、較假手術組高;不同時間點間SOD 活性和MDA 含量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，假手術組各時間點SOD 活性和MDA 含量差異不明顯，模型組和治療組SOD 活性和MDA 含量表達均隨時間延長逐漸下降;分組和時間之間存在交互效應(P＜0.05)(見表4、表5)。

表1 各時間點模型組和治療組神經功能評分比較(±s)

表1 各時間點模型組和治療組神經功能評分比較(±s)

分組主效應:F 組間=26.947，P=0.000;時間主效應:F 時間=19.579，P=0.000;交互效應:F 交互=4.842，P=0.006。#表示與模型組比較，P＜0.05

表2 各時間點3 組間NGB mRNA 表達比較(±s)

表2 各時間點3 組間NGB mRNA 表達比較(±s)

分組主效應:F 組間=1224.040，P=0.000;時間主效應:F 時間=252.000，P=0.000;交互效應:F 交互=64.980，P=0.000。* 表示與假手術組比較，P＜0.05;#表示與模型組比較，P＜0.05

表3 各時間點3 組間NGB 平均光密度值比較(±s)

表3 各時間點3 組間NGB 平均光密度值比較(±s)

分組主效應:F 組間=173.903，P=0.000;時間主效應:F 時間=25.374，P=0.000;交互效應:F 交互=12.352，P=0.000。* 表示與假手術組比較，P＜0.05;#表示與模型組比較，P＜0.05

表4 大鼠腦組織3 個時間點SOD 活性(U/mgpro)(±s)

表4 大鼠腦組織3 個時間點SOD 活性(U/mgpro)(±s)

分組主效應:F 組間=245.01，P=0.000;時間主效應:F 時間=20.059，P=0.000;交互效應:F 交互=9.405，P=0.000。* 表示與假手術組比較，P＜0.05;#表示與模型組比較，P＜0.05

表5 大鼠腦組織3 個時間點MDA 含量(mmol/mgpro)(±s)

表5 大鼠腦組織3 個時間點MDA 含量(mmol/mgpro)(±s)

分組主效應:F 組間=448.833，P=0.000;時間主效應:F 時間=121.918，P=0.000;交互效應:F 交互=26.699，P=0.000。* 表示與假手術組比較，P＜0.05;#表示與模型組比較，P＜0.05

3 討論

腦是機體代謝率最高的器官，缺血時造成細胞能量代謝紊亂，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產生過多，氧化應激損傷，在腦缺血后神經元損傷中起關鍵作用。如何改善腦梗死患者能量代謝和降低氧化應激損傷，成為科研和臨床工作重點。NBP 是從芹菜種子中分離出的有效成分，又叫作芹菜甲素，可阻斷缺血性腦卒中所致?lián)p傷的多個病理環(huán)節(jié)，具有較強抗腦缺血作用。明顯縮小大鼠局部腦缺血梗死面積，減輕水腫，改善能量代謝和缺血區(qū)微循環(huán)和血流量，抑制神經細胞凋亡，以及抗腦血栓形成和抗血小板聚集等藥理作用［4］。

NGB 是繼血紅蛋白和肌紅蛋白之后發(fā)現(xiàn)的攜氧珠蛋白，主要表達在脊椎動物神經系統(tǒng)和視網膜細胞中［5］。目前研究揭示了NGB 作為內生性神經保護因子，在腦梗死和其他神經系統(tǒng)疾病中起作用，關于其機制進行了很多研究。Li 等［6］離體研究證實NGB 通過PTEN-AKT 通路促進軸突再生。Khan等［7］研究認為NGB 通過抑制膜死亡傳導信號復合體形成來保護神經元免受NMDA 和β 淀粉樣蛋白毒性作用。Li 等［8］認為NGB 具有抗氧化特性，減少氧化應激損傷。本實驗結果顯示NGB 主要在神經元表達，神經膠質細胞也有少量表達，與既往研究結果相符。模型組較假手術組、治療組較模型組NGB 表達增高，提示腦缺血時機體啟動了內生性保護因子，減少急性應激損傷。而且丁苯酞可上調NGB 表達減少腦缺血損傷。試驗中NGB 表達隨時間呈下降趨勢，提示其表達已于24h 內達到高峰，即缺血引起NGB 上調已達最大程度。如果刺激持續(xù)存在，神經細胞缺血缺氧亦進一步加重并超出自身代償能力，NGB 表達降低，使細胞供氧進一步下降，缺氧情況急劇惡化，細胞功能喪失并走向死亡。

在腦梗死病理生理中，氧化應激占有重要地位。ROS 過量產生不僅引起脂質、蛋白和DNA 等重要細胞成分氧化，也改變腦梗死中重要信號通路，最終引起細胞損傷和死亡［2］。腦缺血時細胞受自由基攻擊引發(fā)鏈式脂質過氧化反應，形成大量脂質過氧化物，其中以MDA 毒性最大，間接反映機體細胞受自由基攻擊嚴重程度。SOD 是機體清除氧自由基，阻斷自由基病理性連鎖反應最重要的防御酶，其活性測定作為清除氧自由基能力主要指標。實驗結果顯示，模型組較假手術組腦組織中MDA 含量顯著升高，SOD 活性顯著降低，表明腦缺血誘發(fā)了腦組織氧化應激損傷。隨著時間變化，MDA 含量逐漸減少，SOD 活性逐漸升高，可能與ROS 作為機體內抗氧化應激系統(tǒng)信號分子，上調SOD 表達，調控其自身水平有關［9］，啟動腦內代償機制。治療組較模型組MDA 含量下降，SOD 活性升高。提示NBP 可提高腦梗死大鼠SOD 活性，降低MDA 含量。其可以對抗自由基，拮抗過氧化損傷，可能與抑制黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)中超氧陰離子自由基形成有關。Burmester 等［10］認為NGB 有提供氧氣和減少ROS 損傷作用，Watanabe 等［11］研究認為NGB 通過抑制氧化應激引起的cAMP 濃度下降，保護損傷細胞。NBP 可能也通過上調NGB 表達，間接減少氧化應激損傷，發(fā)揮對缺血性神經元保護作用。

綜上所述，NBP 對缺血大鼠腦損傷有保護作用，機制可能為上調缺血腦組織NGB 表達，提高SOD 活性，增加氧供，改善能量代謝，促進自由基清除，對抗脂質過氧化損傷，進而降低MDA 含量，穩(wěn)定細胞膜，改善腦組織病理變化，提高神經元對缺血缺氧耐受性。這可能為NBP 治療腦梗死提供一些理論依據。但NBP 如何上調MCAO 大鼠腦組織中NGB 表達，減少氧化應激損傷需要體外細胞培養(yǎng)進一步研究。

圖1 不同時間點不同組NGB mRNA 表達比較

［1］Burmestern T，Weich B，Reinhardt S，et al.A vertebrate globin express in the brain［J］.Nature，2000，407:520-523.

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