莊俊鴻，徐 堅(jiān)，李小麗

遺傳性痙攣性截癱(hereditary spastic paraplegia，HSP)又稱為家族性Strumpell-Lorrain 病，是一種臨床及遺傳高度異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病，患病率為2/10 萬～9.6/10 萬，臨床多表現(xiàn)為緩慢進(jìn)展的雙下肢無力及痙攣性截癱。主要的遺傳方式有常染色體顯性遺傳(autosomal dominant，AD)、常染色體隱性遺傳(autosomal recessive，AR)和X-連鎖隱性遺傳(X-linked recessive，XR)。1983 年Harding 教授將HSP 分為單純和復(fù)雜二型［1］。目前已被發(fā)現(xiàn)的HSP 基因型有40 余種［2～9］，已克隆的疾病基因有20 個［10］，新近可能有更多的致病被克隆。但在HSP 致病基因中，常染色體顯性遺傳(AD-HSP)最為多見，占70%～80%，其中Spastin 基因突變所致的遺傳性痙攣性截癱4 型(spastic paraplegia-4，SPG4)約占AD-HSP 的40% 左右［11］。國內(nèi)報(bào) 道SPG4 在我國AD-HSP 家系中的突變率為18.2%和20.8%［12～14］，2004 年中南大學(xué)課題組報(bào)道中國漢族人群的AD-HSP 的Spastin 基因微突變頻率為18%［15］，并推測8 號外顯子是中國人Spastin 基因突變熱點(diǎn)，中國人HSP 基因診斷可優(yōu)先考慮篩查Spastin 基因8 號外顯子［12，16］，首次提出我國總體人群HSP 基因診斷的一種思路。眾所周知，我國可是一個多民族的人口大國，區(qū)域間的民族分布特點(diǎn)不盡相同，漢族與少數(shù)民族、少數(shù)民族間HSP 的Spastin 基因突變情況是否一致，目前尚無文獻(xiàn)具體報(bào)道。鑒于此，為了解我國少數(shù)民族人群Spastin 基因突變的情況，我們率先收集到貴州地區(qū)9 例少數(shù)民族HSP 患者，進(jìn)行Spastin 基因外顯子突變的研究分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象 9 例HSP 患者為2009 年～2012 年貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科收治的5 例HSP 患者及經(jīng)過調(diào)查家系中其他家庭成員發(fā)現(xiàn)符合HSP 的4 例患者。當(dāng)中2 例為散發(fā)患者，截止現(xiàn)在無發(fā)現(xiàn)家族的遺傳史。所有患者均嚴(yán)格參照1983年Harding 提出的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷［1］，并由貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科兩位主任醫(yī)師的專家進(jìn)行病史的詢問及詳細(xì)的體格檢查。其中家系1 的2 例患者(Ⅲ1、Ⅲ5)來自貴州省大方縣布依族，家系2 的1 例患者(Ⅱ2)來自貴州清鎮(zhèn)苗族，家系3 的4例患者(Ⅳ1、Ⅳ27、Ⅴ24、Ⅴ25)來自貴州省六盤水市彝族，家系圖譜見圖1;2 例散發(fā)患者(S1、S2)分別來自貴州省貴陽市彝族和興義市的布依族，本研究得到所有參與者的知情同意。

圖1 布依族、苗族、彝族3 個家系圖譜

1.2 DNA 制備 取3 個家系內(nèi)7 例HSP 患者、2 例散發(fā)HSP 患者及家系外100 例無血緣關(guān)系的健康對照者的外周抗凝靜脈血各7～10 ml，使用DNA 提取試劑盒，按照廠家給出的使用方法提取外周血DNA，DNA 保存于-20 ℃冰箱。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genebank 提供的人類正?；蚪M序列，委托生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計(jì)Spastin 基因1-17 號外顯子引物并合成上下游引物，1、17 號外顯子較大，分別設(shè)計(jì)2 對和4對引物，所有引物擴(kuò)增序列覆蓋了各外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)。

1.4 PCR 擴(kuò)增 Spastin 基因外顯子2、8、10、13、14 的PCR 總反應(yīng)體積各為25 μl，其中Master mix(含 dNTP、Mgcl2、Taq 酶、Tris 液等)各為12.5 μl，dd H2O 各為6.5 μl、7.5 μl、7.5 μl、9.5 μl、7.5 μl，Primer1(上游引物)和Primer2(下游引物)分別各為2 μl、2 μl、2 μl、1 μl、2 μl，DNA 各為2 μl、1 μl、1 μl、1 μl、1 μl，PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min→94 ℃變性45 s→外顯子2、8、10、13、14退火45 s(退火溫度分別為66 ℃、56 ℃、56.8 ℃、59 ℃、67 ℃)→72 ℃延伸45 s→30 個循環(huán)后再延伸5 min。外顯子1(1)、1(2)、3、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17(1)、17(2)、17(3)、17(4)的PCR 總反應(yīng)體積各為50 μl，其中Master mix(含dNTP、Mgcl2、Taq 酶、Tris 液等)各為25μl，ddH2O 各為22.5 μl，Primer1(上游引物)和Primer2(下游引物)分別各為1 μl，DNA 各為0.5 μl;PCR 反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性2 min→94 ℃變性30 s→退火30 s(退火溫度分別為62 ℃、62 ℃、55 ℃、55 ℃、57 ℃、59 ℃、63 ℃、55 ℃、55 ℃、55 ℃、65 ℃、57 ℃、55 ℃、57 ℃、59 ℃、59 ℃)→72 ℃延伸30 s→30 個循環(huán)后再延伸2 min。擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，制備1.2～1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，每孔加PCR 產(chǎn)物5 μl，取一孔加5μl DL 2000Marker 或DNA MarkⅠ600 作參照，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓設(shè)為10 V/cm，根據(jù)片段大小電泳相應(yīng)時間，在UVP 凝膠成照相觀察結(jié)果并記錄。

1.5 DNA 序列分析 1-17 號外顯子PCR 產(chǎn)物電泳后均出現(xiàn)清晰的特異性條帶，每個PCR 產(chǎn)物合計(jì)為30～50 μl 封存并-20 ℃冰箱保存，分別委托生工生物工程(上海)有限公司、北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。每個測序結(jié)果與人類基因組Spastin 基因序列進(jìn)行比對(Genebank 序列號AJ246003.1)，Dnastar 軟件分析結(jié)果。測序結(jié)果異常者重提其DNA 再行PCR 擴(kuò)增，進(jìn)行產(chǎn)物正反向測序加以驗(yàn)證。

2 結(jié)果

對9 例HSP 患者進(jìn)行Spastin 基因1-17 個外顯子DNA 直接測序，測序結(jié)果與人類基因組Spastin基因序列進(jìn)行比對后，只有發(fā)現(xiàn)在家系3 中兩例患者(Ⅴ24、Ⅴ25)的Spastin 基因第4 號外顯子在同一位點(diǎn)上發(fā)生錯義突變c.847C＞T，同時經(jīng)基因篩查該家系其它的23 名家庭成員(Ⅲ18、Ⅳ3、Ⅳ5、Ⅳ9、Ⅳ11、Ⅳ25、Ⅳ30、Ⅳ32、Ⅳ37、Ⅳ39、Ⅳ41、Ⅴ1、Ⅴ2、Ⅴ3、Ⅴ4、Ⅴ8、Ⅴ22、Ⅴ23、Ⅴ26、Ⅴ27、Ⅴ28、Ⅴ29、Ⅴ30)及家系外100 例無血緣關(guān)系的健康對照者，未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的突點(diǎn)，推測該位點(diǎn)的突變可能為一多態(tài);另外突變位電均位于外顯子序列前后的內(nèi)含子區(qū)域，Spastin 基因第4 號外顯子測序圖結(jié)果見圖2。

圖2 Spastin 基因第4 號外顯子測序圖結(jié)果

3 討論

HSP 是一種具有高度遺傳異質(zhì)性的神系統(tǒng)變性疾病，分子水平篩查突變致病基因是HSP 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)前把Spastin 基因作為HSP 首選篩查的候選基因。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道:HSP 的基因的突變頻率存在種族間不同［17］，最高為韓國人群［18］，最低為北美人群［19］。亞洲的中國漢族人群spastin 基因的突變率為18.2%，低于日本人41.6%［20］和韓國人64%［21］，表明Spastin 基因突變與種族人群、地域的差異有一定聯(lián)系［17］。在國內(nèi)，我們還有56 個民族，少數(shù)民族占到55 個，其中貴州的少數(shù)民族個數(shù)多達(dá)54 個。他們大多在偏遠(yuǎn)地區(qū)聚集而居，民族間較少或嚴(yán)禁通婚，生活環(huán)境相對封閉，形成了遺傳學(xué)上相對隔離的人群。所以，我們選擇探索貴州地區(qū)的少數(shù)民族人群spastin 基因的突變的特點(diǎn)，期待在該領(lǐng)域得到一定的規(guī)律價(jià)值。

本次篩查的Spastin 基因由Hazan 等［22］定位克隆并命名，包含有17 個外顯子，跨越約110 kb，蛋白含有616 個氨基酸。目前對Spastin 基因的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，可能是Spastin 突變使得微管不能及時解聚，打破了微管聚合或解聚的動態(tài)平衡，微管骨架調(diào)控系統(tǒng)受損，從而干擾了軸突運(yùn)輸而致SPG4［23］，當(dāng)然也有其它的學(xué)說成功報(bào)道。我們還注意到，Spastin 基因已在果蠅建立了動物模型，它主要的突變類型有錯義突變(30%)、缺失突變(19%)、剪接位點(diǎn)突變(18%)［15］，突變的位點(diǎn)覆蓋Spastin 各個區(qū)域，但大多數(shù)點(diǎn)突變位于AAA 盒，該盒定位在spastin 基因序列內(nèi)的342～599 氨基酸，錯義突變主要定位在第7～16 外顯子之間［2～9］，剪接位點(diǎn)突變幾乎都位于外顯子5～1 6［24］。在2009年黃尚志教授［25］就已報(bào)道:除外顯子4 之外，每個外顯子均有突變報(bào)道。然而，經(jīng)我們篩查的9 例HSP 的Spastin 基因1～17 號外顯子，只發(fā)現(xiàn)Spastin基因在一個常染色體顯性遺傳家系3 中兩例患兒(Ⅴ24、Ⅴ25)的第4 號外顯子發(fā)生點(diǎn)突變c.847C＞T。同趙國華等［12］報(bào)道的點(diǎn)突變是中國人主要突變形式相一致，但突變位點(diǎn)不在AAA 盒，也不在4～16 外顯子之間。可見本組資料研究的9 例少數(shù)民族并沒有支持5～16 外顯子是優(yōu)先考慮篩選的外顯子，并有待更大樣本量進(jìn)一步說明。家系內(nèi)成員未有該位點(diǎn)突點(diǎn)，考慮為基因的多態(tài)。

這2 例攜帶Spastin 基因4 號外顯子點(diǎn)突變的患者V24、Ⅴ25 在家系3 中表現(xiàn)為遺傳早現(xiàn)，分別于5 歲、3 歲時起病，在SPG4-HSP 相關(guān)的文獻(xiàn)已有報(bào)道［26～31］，被認(rèn)為是減數(shù)分裂的不穩(wěn)定，3 個核苷酸重復(fù)擴(kuò)增的動態(tài)突變所致，截止目前我們的研究尚未找到相吻合的突變。再之，我們的研究結(jié)果得出該家系兩例患兒的父親及先證者不攜帶Spastin基因4 號外顯子點(diǎn)突變，同時進(jìn)一步篩查該家系內(nèi)自愿參與抽血的23 例成員及100 例無血緣關(guān)系的健康對照者，均未有該位點(diǎn)突變。以上結(jié)果經(jīng)反復(fù)再實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及分析對比趙坤等［17］報(bào)道一個AD-HSP家系在先證者發(fā)現(xiàn)一個位于SPG4 上新型雜合突變，再對家系內(nèi)現(xiàn)癥患者篩查發(fā)現(xiàn)與先證者相同的突變位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)2 例癥狀前患者，國內(nèi)見有多篇類似的文獻(xiàn)報(bào)道［32］，可推測我們發(fā)現(xiàn)c.847C＞T 是一種多態(tài)，不是該家系的致病基因。該位點(diǎn)的突變可能由Ⅴ24，Ⅴ25 這兩兄弟的母親(Ⅳ28)傳遞給他們，只可惜母親已去世，未采集到血標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)過程中無法驗(yàn)證，有待我們積極去聯(lián)系Ⅳ28 的直系親屬，從Ⅳ28 的直系親屬中去尋找這一堿基變異。

同時我們還注意到，四川大學(xué)劉凌等［33］報(bào)道過一個癥狀明顯的AD-HSP 家系，篩查該家系所有患者的Spastin 基因1～17 號外顯子也均未發(fā)現(xiàn)突變，推測與其它基因型有關(guān)。同樣，我們在貴州地區(qū)研究的9 例少數(shù)民族HSP 患者的Spastin 基因1-17 號外顯子也未能找出致病基因，有可能該區(qū)域的Spastin 突變率低于全國。其原因可能有如下兩方面:(1)少數(shù)民族與漢族民族突變的熱點(diǎn)可能不同，不排除存在區(qū)域差異性。(2)我們納入的樣本量少，部分少數(shù)民族Spastin 基因突變特點(diǎn)尚與我們研究的目的存在偏差。但需指出的是，截止目前，筆者的研究課題組也未發(fā)現(xiàn)新的少數(shù)民族HSP 病例，單獨(dú)收集少數(shù)民族的HSP 病例實(shí)屬難度較大，納入較大樣本量的研究目前不易做到。此外，雖然全國各地陸續(xù)有HSP 突變在不同人群的報(bào)道，可我們根本不了解民族間有無差異。從近幾年文獻(xiàn)報(bào)道中，西南地區(qū)(貴州、四川)的Spastin 突變的陽性率很低，造成HSP 基因診斷的成本代價(jià)很高，對我們未來在臨床上開展遺傳咨詢、基因診斷、癥狀前診斷、基因治療帶來極大挑戰(zhàn)和困難，給患者、家人、社會增加更多經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

綜上所述，我們現(xiàn)階段的研究未能得出少數(shù)民族與漢族人群HSP 較為明確的異同點(diǎn)，但我們研究的目的在于探索出一條更適合我國不同民族的篩查途徑，為將來不同民族與區(qū)域的人群HSP 致病基因篩查提供參考，可節(jié)省很多人力物力，從而給HSP患者帶來福音，幫助患者逐代消除HSP，滿足生健康下一代的要求。

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