劉麗英　曲文玉　蔣麗　張曉麗　劉曉莉　孔剛

(遼寧省沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院生殖中心，遼寧沈陽(yáng)　110014)

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·論著·

玻璃化冷凍及程序冷凍對(duì)人卵巢組織卵泡活性的影響

劉麗英曲文玉蔣麗張曉麗劉曉莉孔剛

(遼寧省沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院生殖中心，遼寧沈陽(yáng)110014)

摘要目的：比較玻璃化冷凍及程序冷凍對(duì)人卵巢組織卵泡活性的影響。方法： 將15例人卵巢組織20 min內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，切割成1 mm×5 mm×5 mm大小的卵巢皮質(zhì)片，隨機(jī)分為新鮮組、玻璃化冷凍組及程序冷凍組。玻璃化冷凍組及程序冷凍組均采用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。新鮮及復(fù)蘇組織體外培養(yǎng)后，在光鏡及電鏡下分析卵泡的形態(tài)正常率，采用激素釋放試驗(yàn)及異體移植試驗(yàn)檢測(cè)冷凍復(fù)蘇的人卵巢組織的功能，并與新鮮組比較。結(jié)果：冷凍復(fù)蘇組及新鮮對(duì)照組卵巢組織皮質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)形態(tài)正常和異常的始基及初級(jí)卵泡，新鮮對(duì)照組卵泡形態(tài)正常率顯著高于玻璃化冷凍組和程序冷凍組(P<0.05)；程序冷凍組形態(tài)正常率稍高于玻璃化冷凍組(P>0.05)。3組均可見(jiàn)超微結(jié)構(gòu)正常及異常的原始卵泡、初級(jí)卵泡。卵巢皮質(zhì)片體外培養(yǎng)后持續(xù)分泌雌二醇和孕酮。新鮮組激素分泌水平高于玻璃化冷凍組和程序冷凍組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。異體移植試驗(yàn)顯示，程序冷凍組較玻璃化冷凍組具有更高的移植物回收數(shù)及卵泡密度。結(jié)論：由于程序冷凍人卵巢組織卵泡具有較高的發(fā)育潛能，因此其較玻璃化冷凍更有應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞玻璃化冷凍；程序冷凍；人卵巢組織；激素釋放試驗(yàn)；超微結(jié)構(gòu)；移植

基本項(xiàng)目：遼寧省沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)基金項(xiàng)目(編號(hào)：F14-158-9-13)通訊作者

劉麗英，E-mail: llying007@sohu.com

近年來(lái)，人卵巢組織冷凍復(fù)蘇技術(shù)的臨床應(yīng)用已經(jīng)取得巨大進(jìn)展，全球已有十余例活嬰出生[1-2]。研究[3]表明，卵巢組織冷凍保存是保存女性生育能力和內(nèi)分泌功能的有效方法。卵巢組織冷凍不延誤癌癥患者的最佳治療時(shí)機(jī)、不需要復(fù)雜的促排卵及取卵過(guò)程，是青春期前及年輕女性患者保存生育能力的最佳方法[4]。目前用于卵巢組織冷凍的方法主要有玻璃化冷凍和程序冷凍。有研究[5-6]比較了這2種方法的冷凍效果，所得出的結(jié)論有所不同。本研究旨在比較玻璃化冷凍及程序冷凍對(duì)人卵巢組織卵泡活性的影響。

1資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源卵巢組織來(lái)源于遼寧省沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院婦科2013年6月—2014年7月因卵巢良性腫瘤需行腹腔鏡或手術(shù)切除的15例患者，術(shù)后病理證實(shí)為卵巢良性腫瘤。15例患者年齡為25～35歲，平均(30.8±2.2)歲；且近半年無(wú)服用激素藥物史，具有內(nèi)分泌功能，術(shù)前至少3個(gè)月未進(jìn)行過(guò)放療和(或)化療。收集病理檢查證實(shí)的正常卵巢組織。本研究經(jīng)遼寧省沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2卵巢組織的制備將術(shù)中取出的卵巢組織置于裝有預(yù)冷卵泡沖洗液(G-mops Vireolife)的無(wú)菌試管內(nèi)，置于冰上，20 min內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗卵巢組織3次，用刀片切除髓質(zhì)部分，僅保留卵巢皮質(zhì)，切割成1 mm×5 mm×5 mm大小的組織塊，整個(gè)切割過(guò)程在15 min內(nèi)完成。將每例患者的卵巢組織均隨機(jī)分為3組：新鮮對(duì)照組、玻璃化冷凍組及程序冷凍組。

1.3卵巢組織的冷凍與解凍

1.3.1玻璃化冷凍冷凍：卵巢皮質(zhì)片在冷凍基礎(chǔ)液[PBS+10%人血清白蛋白(HSA)]中平衡5 min后，轉(zhuǎn)入冷凍液VS1[0.35 mol/L 二甲基亞砜(DMSO)、0.38 mol/L 丙二醇(PROH)、0.38 mol/L 乙二醇(EG)、冷凍基礎(chǔ)液]5 min，VS2(0.7 mol/L DMSO、0.75 mol/L PROH、0.75 mol/L EG、冷凍基礎(chǔ)液)5 min ，VS3[1.4 mol/L DMSO、1.5 mol/L PROH、1.5 mol/L EG、質(zhì)量體積比(W/V)10% 的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、冷凍基礎(chǔ)液]5 min，VS1及VS2均在室溫下輕輕震蕩平衡，VS3在4 ℃條件下平衡，采用堅(jiān)硬表面玻璃化冷凍法冷凍。復(fù)溫：37 ℃解凍，依次經(jīng)過(guò)解凍液1、2、3、4(解凍液1：0.5 mol/L蔗糖(S)、PBS、10% HSA；解凍液2：0.25 mol/L S、PBS、10% HSA；解凍液3：0.125 mol/L S、PBS、10% HSA；解凍液4：PBS、10%HSA)，各5 min，室溫輕輕震蕩，去除冷凍保護(hù)劑。

1.3.2程序冷凍冷凍：卵巢組織裝入含6 mL卵巢冷凍液的15 mL試管中(含10%胎牛血清、1.5 mol/L EG、0.1 mol/L S的PBS)，于4 ℃搖床平衡30 min，裝入1.8 mL的細(xì)胞凍存管，置于Planner程序降溫儀中。-2～-9 ℃，2 ℃/min；-9～-40 ℃，0.3 ℃/min；-40～-140 ℃，10 ℃/min；-9 ℃植冰，冷凍曲線保存于計(jì)算機(jī)中，凍存管轉(zhuǎn)移至液氮保存。解凍：37 ℃水浴，直至凍存管中的冰晶全部溶解，卵巢皮質(zhì)片依次經(jīng)過(guò)解凍液1、2、3(解凍液1：含0.75 mol/L EG，0.25 mol/L蛋白S；解凍液2：含0.25 mol/L S；解凍液3：PBS)各10 min，室溫輕輕震蕩，去除冷凍保護(hù)劑。

1.4體外培養(yǎng)將新鮮及解凍的卵巢皮質(zhì)片轉(zhuǎn)移到含有2 mL卵泡培養(yǎng)液[含1%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(Its)、100 U/L的卵泡刺激素(FSH)、10 U/L的黃體生成素(LH)、5%胎牛血清(FCS)的α-MEM]的35 mm培養(yǎng)皿中，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，隔日換液，收集培養(yǎng)液，凍于-80 ℃冰箱中待用。培養(yǎng)12 d后收集培養(yǎng)的卵巢皮質(zhì)片用于組織學(xué)鑒定。

1.5組織學(xué)鑒定

1.5.1光鏡分析冷凍復(fù)蘇卵泡的組織學(xué)結(jié)構(gòu)將所有新鮮和冷凍復(fù)蘇后培養(yǎng)的卵巢皮質(zhì)片在4%多聚甲醛固定24 h，然后進(jìn)行脫水、二甲苯透明、乙醇逐級(jí)脫水和石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚5 μm。用切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，樹(shù)膠封片。為避免卵泡的重復(fù)計(jì)數(shù)，每10張連續(xù)片計(jì)數(shù)1次。按照Gougeon等[7]的標(biāo)準(zhǔn)觀察卵泡形態(tài)，計(jì)數(shù)形態(tài)正常及異常的卵泡。

1.5.2透射電鏡觀察冷凍復(fù)蘇卵泡的超微結(jié)構(gòu)新鮮及冷凍復(fù)蘇后培養(yǎng)的卵巢皮質(zhì)片置于2.5%的戊二醛中固定，包埋修塊后切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下定位組織學(xué)形態(tài)正常的卵泡，用鉆石刀進(jìn)行超薄切片后經(jīng)醋酸鈾及硝酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察卵泡超微結(jié)構(gòu)。

1.6激素釋放試驗(yàn)解凍冷凍保存的培養(yǎng)液，采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定雌二醇(E2)及孕酮(P)水平，E2的敏感性為5.0 μg/L，P的敏感性為0.1 ng/mL。

1.7卵巢組織植入裸鼠體內(nèi)8周齡SPF級(jí)性成熟雌性裸鼠(SCID)30只，體質(zhì)量21～26 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將30只裸鼠隨機(jī)分為新鮮組、玻璃化冷凍組、程序冷凍組，每組10只。腹腔注射氯胺酮75 mL/kg麻醉小鼠；75%乙醇消毒裸鼠腹部皮膚，剪開(kāi)腹部皮膚，分離腹部皮下組織，將待移植的卵巢皮質(zhì)片切割成1 mm×1 mm×1 mm大小，用眼科鑷夾取卵巢組織塊并將其多點(diǎn)移植于腹部皮下，縫合皮膚、標(biāo)記并再次消毒。移植1個(gè)月后取出移植物，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。樣本率的比較采用Fisher's確切概率法或χ2檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1光鏡分析結(jié)果本研究主要對(duì)原始卵泡及初級(jí)卵泡進(jìn)行分析，因其他發(fā)育階段的卵泡數(shù)目較少。形態(tài)正常的卵泡表現(xiàn)為圓形卵泡、卵母細(xì)胞，顆粒細(xì)胞分布均勻，基底膜完整。如果卵泡與卵母細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，顆粒細(xì)胞不完整，出現(xiàn)核固縮，則為形態(tài)異常的卵泡。冷凍復(fù)蘇組及新鮮組卵巢組織皮質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)形態(tài)正常和異常的始基卵泡及初級(jí)卵泡，見(jiàn)圖1。新鮮組卵泡形態(tài)正常率顯著高于玻璃化冷凍組和程序冷凍組(P<0.05)，程序冷凍組形態(tài)正常率稍高于玻璃化冷凍組(P>0.05)。見(jiàn)表1。

A：形態(tài)正常的始基卵泡、初級(jí)卵泡；B：形態(tài)異常的始基卵泡、初級(jí)卵泡、卵母細(xì)胞皺縮

圖1　光鏡下觀察人卵泡的形態(tài)(HE染色，×200)

注：與其他2組比較，*P<0.05

2.2透射電鏡分析結(jié)果3組中均可見(jiàn)超微結(jié)構(gòu)正常的原始卵泡、初級(jí)卵泡。卵母細(xì)胞居中、圓形，核膜及核仁清晰完整，卵母細(xì)胞膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜完整，顆粒細(xì)胞膜完整，排列整齊，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞核完整，染色質(zhì)分布均勻。冷凍標(biāo)本中可見(jiàn)部分卵子的胞核及胞漿模糊，不能清晰辨認(rèn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，線粒體腫脹，基質(zhì)暗淡，個(gè)別卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞胞漿中無(wú)細(xì)胞器區(qū)和空泡增多。見(jiàn)圖2。

2.3激素釋放試驗(yàn)卵巢皮質(zhì)片體外培養(yǎng)后持續(xù)分泌E2和P，新鮮組激素分泌水平高于玻璃化冷凍組和程序冷凍組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

A：正常原始卵泡：卵母細(xì)胞核規(guī)整，有明顯的核仁及異染色質(zhì)，胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富；B：異常的初級(jí)卵泡：胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡(#)及無(wú)細(xì)胞器區(qū)(*)，顆粒細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量無(wú)細(xì)胞器區(qū)域(+++)

圖2透射電鏡下觀察人卵泡的形態(tài)(×30 000)

圖3　新鮮及冷凍復(fù)蘇卵巢組織經(jīng)體外培養(yǎng)后E2及P值的變化

2.4卵巢組織異體移植結(jié)果解剖裸鼠后尋找移植物。30只裸鼠中25只找到移植物，其余5只移植失敗，僅見(jiàn)很小的纖維化結(jié)節(jié)。組織學(xué)檢測(cè)顯示移植物已有新生血管生成，可見(jiàn)不同發(fā)育階段的卵泡。新鮮組移植效果最好，15個(gè)移植物中共見(jiàn)36個(gè)卵泡；程序冷凍組12個(gè)移植物中共見(jiàn)25個(gè)卵泡；玻璃化冷凍組移植效果較差，8個(gè)移植物中共見(jiàn)13個(gè)卵泡。見(jiàn)圖4。

圖4　經(jīng)冷凍復(fù)蘇異體移植后卵巢組織的組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3討論

程序冷凍是傳統(tǒng)的冷凍方法，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于卵巢組織的冷凍。該方法應(yīng)用低濃度冷凍保護(hù)劑，使其在緩慢降溫過(guò)程中脫水，避免細(xì)胞內(nèi)冰晶形成。冷凍保護(hù)劑的類(lèi)型及濃度是影響冷凍保存效果的重要因素。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，采用EG(1.5 mol/L)的冷凍效果最好，因此，本研究亦采用EG(1.5 mol/L)作冷凍保護(hù)劑。

玻璃化冷凍是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的冷凍保存技術(shù)。該方法應(yīng)用的高濃度冷凍保護(hù)劑能充分滲透至細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)快速降溫，使細(xì)胞內(nèi)外的液態(tài)直接轉(zhuǎn)化成黏稠、無(wú)結(jié)構(gòu)的非晶體玻璃化狀態(tài)，從而最大限度地降低了細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，減輕了對(duì)細(xì)胞的冷凍損傷。Vajta等[8]研究認(rèn)為，玻璃化冷凍比慢速冷凍更為有效和可靠，是未來(lái)冷凍技術(shù)的發(fā)展方向。

目前已有多項(xiàng)研究比較了玻璃化冷凍及程序冷凍的效果，但得出的結(jié)論不同。2004年Rahimi等[5]對(duì)人卵巢組織玻璃化及程序冷凍進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷凍效果的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2006年Gandolfi等[6]對(duì)人、牛及豬的卵巢組織進(jìn)行了玻璃化冷凍及程序冷凍，得出的結(jié)論是，慢速冷凍能夠更好地保存卵泡中的各種細(xì)胞。2007年Li等[9]對(duì)玻璃化冷凍及程序冷凍的研究中，第1組采用2.5 mol/L DMSO+2.5 mol/L 丙二醇+0.2 mol/L蔗糖作為冷凍保護(hù)劑直接投入液氮的玻璃化冷凍方法；第2組采用1.5 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖的程序冷凍方法；培養(yǎng)2周后檢測(cè)正常卵泡的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Isachenko 等[10]2007年應(yīng)用Li等[9]的玻璃化冷凍方法檢測(cè)玻璃化冷凍的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)程序冷凍的卵泡質(zhì)量更好。隨后，玻璃化冷凍的方法得到優(yōu)化，經(jīng)冷凍復(fù)蘇、培養(yǎng)后可獲得較高質(zhì)量的卵泡[11]。2009年，Isachenko等[12]將優(yōu)化的玻璃化冷凍方案與程序冷凍法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2種方法冷凍的卵巢組織在形態(tài)及內(nèi)分泌功能方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在分子生物學(xué)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，玻璃冷凍組有大量的完整RNA的降解[12]。他們的結(jié)論是，程序化冷凍具有更好的發(fā)育潛能，更有應(yīng)用前景。2009年Keros等[13]對(duì)2種程序冷凍法以及2種玻璃化冷凍法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用PROH、EG、DMSO和PVP的玻璃化冷凍方案可更好地保持卵泡完整性。堅(jiān)硬表面玻璃化法(SSV)是將含有卵巢組織的液滴直接滴到在液氮中預(yù)冷的固體表面，進(jìn)行玻璃化冷凍。一些學(xué)者[14-15]采用SSV作為載體對(duì)卵巢組織進(jìn)行玻璃化冷凍，發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇后卵泡的活力優(yōu)于傳統(tǒng)玻璃化冷凍法。因此本研究采用Keros等[13]的玻璃化冷凍法，采用SSV作為冷凍載體進(jìn)行玻璃化冷凍。

本研究采用玻璃化冷凍及程序冷凍法冷凍人卵巢組織，觀察新鮮卵巢組織與冷凍復(fù)蘇卵巢組織的形態(tài)。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)冷凍后，2種方法復(fù)蘇的卵巢組織的卵泡形態(tài)正常率均低于新鮮組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)在冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中人卵巢組織受到一定的損傷。程序冷凍卵巢組織的形態(tài)正常率稍高于玻璃化冷凍組，但差異不顯著。程序冷凍組始基卵泡的形態(tài)正常率比初級(jí)卵泡高，這可能是由于始基卵泡的體積小，代謝率低、缺少細(xì)胞器及皮質(zhì)顆粒，對(duì)低溫敏感性差，比其他卵泡更能耐受冷凍過(guò)程，因此凍融后始基卵泡的存活率較高。但是，玻璃化冷凍組始基卵泡及初級(jí)卵泡的形態(tài)正常率相差不多，這可能是由于高濃度的冷凍保護(hù)劑及快速的降溫速度更適用于體積稍大的初級(jí)卵泡。對(duì)人卵巢組織超微結(jié)構(gòu)的研究表明：無(wú)論程序冷凍還是玻璃化冷凍，經(jīng)培養(yǎng)后均可造成部分卵泡超微結(jié)構(gòu)的改變，這些細(xì)微的結(jié)構(gòu)改變是否對(duì)卵泡生物活性產(chǎn)生影響，還需要進(jìn)一步研究。

冷凍復(fù)蘇后培養(yǎng)組織的激素活性測(cè)定是評(píng)價(jià)冷凍方案有效性的一個(gè)佐證。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮及冷凍卵巢組織中E2及P的含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，提示卵巢組織在體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)發(fā)育良好；3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究[16]顯示，不僅僅是卵泡可以產(chǎn)生類(lèi)固醇激素，取自絕經(jīng)期卵巢皮質(zhì)片中增生的基質(zhì)細(xì)胞(在體或離體)也能產(chǎn)生E2。因此，冷凍卵巢組織的內(nèi)分泌功能與生殖功能之間的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。卵巢組織的異體移植更加確切地說(shuō)明了冷凍過(guò)程對(duì)卵巢功能的影響，經(jīng)過(guò)異體移植發(fā)現(xiàn)，程序冷凍法較玻璃化冷凍法具有更高的移植物回收率及卵泡密度。

通過(guò)組織學(xué)、激素釋放試驗(yàn)及異體移植試驗(yàn)?zāi)軌蚋玫貦z測(cè)卵泡的存活狀態(tài)。本研究的結(jié)果表明，玻璃化冷凍法與程序冷凍法雖然在形態(tài)學(xué)檢測(cè)及激素釋放試驗(yàn)方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在異體移植試驗(yàn)中程序冷凍法的效果優(yōu)于玻璃化冷凍法。因此，本研究得出結(jié)論是：由于程序冷凍法冷凍的人卵巢組織卵泡具有較高的發(fā)育潛能，因此較玻璃化冷凍法更有應(yīng)用前景。

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Effects of Vitrification and Program Freezing on the Follicular Viability of Human Ovarian Tissues

LIULiyingQUWenyuJIANGLiZHANGXiaoliLIUXiaoliKONGGangCenterofReproductiveMedicine,Women′sandChildren′sHospitalofShenyanginLiaoningProvince,Shenyang110014,China

AbstractObjective：To compare the effect of vitrification and program freezing on the follicular viability of human ovarian tissues. Methods: Ovarian tissues from 15 patients were transported to the laboratory within 20 min after excision. Pieces of ovarian tissues (1 mm×5 mm×5 mm)were randomly divided into fresh group, vitrification group and program freezing group.Optimal experimental method was used in vitrification group and program freezing group. The fresh and resuscitated tissues were cultivated in vitro, and the follicular morphology was analyzed by using light and electron microscope.The viability of ovarian tissues resuscitated from freezing was detected by hormones releasing assay and allograft assay, and then compared with that of fresh group. Results: Morphologically normal and abnormal primordial and primary follicles could be seen in resuscitated freezing group and fresh group. The rate of morphologically normal follicles in fresh group was significantly higher than those in vitrification group and program freezing group(P<0.05).The rate of morphologically normal follicles was slightly higher in program freezing group than that in vitrification group(P>0.05). Primordial and primary follicles with normal and abnormal ultrastructure could be seen in all the three groups.Ovarian cortical pieces secreted estradiol and progesterone continuously after in vitro culture. Hormone levels in fresh group were higher than those in vitrification group and program freezing group(P>0.05). Allograft assay showed that there were more graft recovery number and higher follicular density in program freezing group than those in vitrification group. Conclusions: Follicle has higher potentiality of development in program freezing human ovarian tissues,so program freezing is more promising than vitrification in application.

Key WordsVitrification；Program freezing；Human ovarian tissues；Hormone releasing assay；Ultrastructure；Transplantation

通訊作者劉敏，E-mail：lm18950009388@sina.com

中圖分類(lèi)號(hào)R71

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A