張巍　錢晟　瞿旭東　朱梁　周波　楊國威　王建華　劉嶸　顏志平

(復旦大學附屬中山醫(yī)院介入治療科，上?！?00032)

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·論著·

E-cadherin在經動脈栓塞治療肝癌時的表達及其與肝癌肺轉移的關系

張巍錢晟瞿旭東朱梁周波楊國威王建華劉嶸顏志平

(復旦大學附屬中山醫(yī)院介入治療科，上海200032)

摘要目的：對大鼠肝癌模型行經動脈栓塞治療，探討栓塞治療對肝癌肺轉移及E-cadherin表達的影響。方法： 選取40只Buffalo大鼠，建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的大鼠肝癌模型。將大鼠隨機分成4組，每組10只。對照組(A組)：胃十二指腸動脈逆行插管，注入0.9%氯化鈉液0.2 mL；肝動脈結扎組(B組)：分離肝動脈后用縫線結扎；小劑量栓塞組(C組)：胃十二指腸動脈逆行插管，注入超液化碘油(0.2 mL/kg)；大劑量栓塞組(D組)：胃十二指腸動脈逆行插管，注入超液化碘油(0.4 mL/kg)。術后觀察體質量及腫瘤變化。21 d后處死大鼠，收集肝和肺標本，觀察腫瘤生長變化及肺轉移情況。采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應法、蛋白質印跡法、免疫組織化學法檢測腫瘤組織中的E-cadherin的mRNA及蛋白表達水平。結果：術后 21 d，D組肝臟腫瘤生長較其他3組明顯受抑；B、C組肝臟腫瘤生長較A組明顯受抑(P<0.01)。D組肺轉移個數少于其他3組(P<0.01)。D組E-cadherin mRNA和蛋白相對表達水平高于A、B、C組，差異均有統計學意義(P<0.01)。D組E-cadherin陽性細胞百分比高于其他3組，差異均有統計學意義(P<0.01)。結論：在大鼠肝癌模型中，經動脈栓塞治療肝癌可增加E-cadherin表達，大劑量的碘油栓塞能抑制腫瘤生長，降低肺轉移。

關鍵詞肝癌；栓塞；大鼠；肺轉移；E-cadherin

基本項目：國家自然科學基金資助項目(編號：81171432；81350031)

中國是肝癌發(fā)病率最高的國家。中國肝癌患者約占世界肝癌患者的55%，其中以肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)居多[1]。目前，對于不具備手術切除條件的肝癌患者，臨床上多采用以介入治療為主的治療方法，例如經肝動脈化療栓塞術(transarterial chemoembolization，TACE)已成為不具備手術切除條件的肝癌患者的最主要選擇[2]。但如何評價TACE治療效果則是當前的重要議題。E-cadherin作為一種細胞黏附分子，是介導細胞間黏附、保持上皮細胞形態(tài)和結構完整的關鍵分子，其結構改變或數量增減均會影響細胞分化和組織形態(tài)，可導致癌細胞的脫落和轉移[3]。同時，E-cadherin是重要的腫瘤轉移抑制基因，其表達與肝癌的侵襲轉移呈負相關[4]。本研究擬對大鼠肝癌模型行經動脈栓塞(transarterial embolization，TAE)治療，旨在探討TAE對肝癌肺轉移及E-cadherin表達的影響。

1資料與方法

1.1細胞與動物大鼠肝癌McA-RH7777細胞株中(購自美國ATCC)加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

SPF級近交系Buffalo大鼠，8周齡、雄性、體質量(220±3)g，購自美國Charles River Laboratory，復旦大學附屬中山醫(yī)院動物中心飼養(yǎng)。

1.2主要試劑與儀器DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco BRL公司)；胰酶消化液(美國Difco公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)；實時熒光定量-聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR)試劑盒(美國Promega公司)；蛋白質印跡(Western blotting)試劑盒(美國Millipore公司)；Puromycin(美國Sigma-Aldrich公司)；小鼠E-cadherin單克隆抗體、小鼠β-actin單克隆抗體(美國Abcam公司)；山羊抗小鼠IgG抗體(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；超液化碘油(法國Gubert公司)；Silastic laboratory tubing(美國Dow Corning公司)；體視顯微鏡(日本Nikon公司)；1.5T超導磁共振成像儀(配小動物專用線圈，德國Siemens公司)；熒光顯微鏡Leica M205(德國Leica公司)；Carestream多模式小動物成像系統(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)。

“見到靜秋，很偶然。前些日子和楚歌去一家茶館喝茶，竟然見到她。茶館是她和她老公的，已經開了兩年多。一直沒告訴你，是怕你多想。再說，有什么可告訴你的呢？靜秋現在只是我的朋友，我總不能每交一個朋友，都要向娘子匯報吧？靜秋是我的初戀，這不假，可是時間過去了這么久，當初再旺的一團火，也早熄滅了。昨天晚上，真的沒打算叫她。楚歌和莫高都在，你不相信的話，現在就可以給他們打個電話……”

2.1大鼠生物學行為及體質量變化術后3 d各組大鼠均進食差，其中D組進食最差，A、B、C組在3 d后進食恢復正常；術后14 d各組大鼠活動差、毛發(fā)欠光澤，部分肛門口出現污穢等。4組大鼠術前體質量差異無統計學意義。D組大鼠體質量在術后5 d逐漸增加，D組大鼠術后7 d體質量為(247.9±13.13)g，但較術前[(264.8±12.27)g]下降(P<0.05)；術后21 d時的體質量為(243.4±18.71)g，與A組[(217.9±17.76)g]比較差異有統計學意義(P<0.05)，與B、C組差異無統計學意義。見圖2。

里帕的借鑒方式簡單直接：如擬人形象“友誼”（方案D），他說“一個瞎子背著一個瘸子行路”的形象來表現“友誼”主題，是出自阿爾恰托的描述：“他在一個瞎子的背上，用聲音領路。所以兩人組合在一起意味著，一個提供視力一個提供腳力”。?

A：McA-RH7777細胞；B：McA-RH7777/EGFP細胞

圖1McA-RH7777/EGFP細胞在熒光顯微鏡下

激發(fā)熒光后顯示綠熒光(×200)

1.3.2實驗動物分組及治療選取造模后的Buffalo大鼠40只。造模后7 d經磁共振掃描證實肝內成瘤，40只大鼠成瘤率達100%。在造模后17 d，按照隨機數字表將大鼠隨機分為4組，每組10只。對照組(A組)：開腹行胃十二指腸動脈逆行插管，注入0.9%氯化鈉液0.2 mL；肝動脈結扎組(B組)：開腹分離肝動脈后用縫線結扎；小劑量栓塞組(C組)：開腹行胃十二指腸動脈逆行插管，注入超液化碘油(0.2 mL/kg)與0.9%氯化鈉液(碘油∶0.9%氯化鈉液=1∶2)；大劑量栓塞組(D組)：開腹行胃十二指腸動脈逆行插管，注入超液化碘油(0.4 mL/kg)與0.9%氯化鈉液(碘油∶0.9%氯化鈉液=1∶2)。

2.4E-cadherin檢測結果real-time PCR結果發(fā)現，D組E-cadherin mRNA的相對表達水平[(1.66±0.38)]高于A組[(0.99±0.39)]、B組[(0.80±0.23)]、C組[(0.86±0.24)]，差異均有統計學意義(P<0.05)；A、B、C組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4a。Western blotting分析結果顯示A、B、C、D組E-cadherin蛋白的相對表達水平分別為(0.13±0.06)、(0.12±0.04)、(0.13±0.03)、(0.32±0.09)，D組高于A、B、C組，差異均有統計學意義(P<0.01)；A、B、C組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4b和圖5。免疫組織化學結果顯示，E-cadherin為包膜染色，在腫瘤組織中表達量偏低，D組計數陽性細胞百分比為(18.60±3.78)%，與A組[(9.90±1.85)%]、B組[(8.10±2.81)%]、C組[(10.70±2.16)%]比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；A、B、C組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4c和圖6。

正常肝組織的血供70%～75%來源于門靜脈，25%～30%來源于肝動脈。肝癌組織的血供中95%～99%由肝動脈供給，阻斷肝動脈后，腫瘤血供減少90%，而正常肝臟組織血供一般不受影響。腫瘤組織對于缺血、缺氧敏感性較高，腫瘤血管粗細不等、血流緩慢、發(fā)育不全，且有虹吸現象，能夠使化療藥物和栓塞劑滯留在腫瘤血管內。因此，TACE治療腫瘤時，經肝動脈選擇性地將化療藥注入病灶內，可以使腫瘤組織中的藥物濃度比正常肝組織高10倍以上，腫瘤細胞壞死明顯，而正常肝臟受影響??；術中注入的栓塞劑能夠栓塞毛細血管、小動脈及動脈主干，造成腫瘤局部血供中斷或明顯減少，從而減少血流進入化療藥物滯留的血管處，使化療藥物緩慢釋放，進而導致腫瘤局部缺血、壞死，延長患者生存期[5]。選擇TACE的患者主要為不能手術切除的中晚期肝癌患者，所以，對于TACE是否會促進肝癌轉移一直有爭議。有研究[6]認為，部分肝癌患者對手術前TACE治療無效，且術前如多次TACE治療可使肝臟明顯受損，導致肝組織水腫，降低患者對肝切除的耐受能力，增加手術難度，且術后并發(fā)癥發(fā)生率和病死率增加；同時，TACE后，殘留的腫瘤細胞侵襲能力增加、黏附力下降，從而增加腫瘤轉移機會。但另有研究顯示，肝癌患者從TACE中獲益：Llovet等[7]的一項隨機對照研究顯示，TACE組的1、2年生存率為83%、63%，而保守治療組為63%、27%，差異有統計學意義(P<0.01)；Lo等[8]報告，TACE組1、3、5年的生存率為57%、31%、26%，而對照組為32%、11%、3%，差異有統計學意義(P<0.01)。

定義1[12] GF(q)(q≠2)上生成多項式g(x)包含αl0,αl0+1,…,αl0+2t-1等2t個連續(xù)根的本原BCH碼稱為RS碼.

1.3.5術后各部位腫瘤灶觀察術后21 d，給予10%水合氯醛麻醉后處死大鼠。采用熒光顯微鏡及小動物成像系統觀察肝內腫瘤、肺部轉移等情況。由2位研究者在熒光顯微鏡下結合小動物成像系統，記錄肺部轉移灶并分級：Ⅰ級直徑小于0.5 mm；Ⅱ級直徑0.5～1.0 mm；Ⅲ級直徑1～2 mm；Ⅳ級直徑大于2 mm?？傓D移灶數=Ⅰ級(結節(jié)數)×1+Ⅱ級×2+Ⅲ級×3+Ⅳ級×4。根據總轉移灶數分級：1～20個為Ⅰ級，21～40個為Ⅱ級，40個以上為Ⅲ級。

2.3各組肺轉移情況術后21 d，所有大鼠均有肺轉移，肺轉移率為100%。用Fisher精確概率計算P值。D組Ⅰ、Ⅲ級與A、B、C組兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；A、B、C組兩兩比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

雖然糖尿病史遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結果[3]，但生活方式也是影響糖尿病患病與控制的重要因素[4]，研究顯示，通過健康促進與健康教育改變患者生活方式能夠降低糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生率[5]，生活方式干預是控制糖尿病前期患者血糖的有效手段[6,7]。但如果僅僅采用常規(guī)健康教育，而缺乏有效的督促和監(jiān)督，患者往往執(zhí)行力低、依從性差，使得生活方式干預不能有效地發(fā)揮作用。本課題利用微信通訊手段發(fā)揮督促和監(jiān)督作用，有效地干預了患者的生活方式，提高患者執(zhí)行力和依從性，從而發(fā)揮了良好的血糖控制作用。

1.3方法

2結果

1.3.1穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白大鼠肝癌模型的建立通過包裝慢病毒載體，將攜帶增強型綠色熒光蛋白(enhance green fluorescent protein，EGFP)的慢病毒轉染至McA-RH7777細胞株，并進行篩選和單克隆，構建出表達綠色熒光蛋白的單克隆細胞株，見圖1。McA-RH7777/EGFP細胞株皮下注射形成成瘤后，制備瘤組織塊；直視下開腹，將瘤組織塊種植到Buffalo大鼠的肝臟，制備大鼠肝癌模型。

圖2　各組大鼠術后體質量變化

2.2肝內腫瘤體積變化術前各組肝內腫瘤體積差異無統計學意義。術后7、14、21 d，B、C、D組肝內腫瘤體積小于A組，D組肝內腫瘤體積小于B、C組。D組術后21 d肝內腫瘤體積為(2208.7±288.21)mm3，與A組[(4189.8±633.07)mm3]比較，差異有統計學意義(P<0.01)。B組為(2947.1±382.67)mm3，與C組[(2778.5±329.15)mm3]比較，差異無統計學意義；與A、D組比較，差異均有統計意義(P<0.05)。見圖3。

圖3　各組大鼠術后肝內腫瘤體積變化

1.3.6E-cadherin的檢測取保存于液氮中的瘤組織，采用real-time PCR、Western blotting法檢測E-cadherin的表達；取保存于甲醛中的同編號的瘤組織，采用免疫組織化學法檢測E-cadherin陽性細胞。其中E-cadherin上游引物：5′-CCCTGTCTCTGAATCCAACC-3′，下游引物：5′-TCAATGATGAAAACGCCAAC-3′。小鼠E-cadherin單克隆抗體稀釋濃度：免疫組織化學法為1∶200、Western blotting法為1∶1000。

表1　各組治療后肺轉移灶分級情況比較　　 (n，%)

注：與B組比較，*P<0.05；與A、C組比較，△P<0.05

1.3.3大鼠一般情況觀察術后持續(xù)觀察各組大鼠體質量變化，觀察精神、進食、毛色及糞便性狀。

a：real-time PCR結果；b：Western blotting結果；c：免疫組織化學結果。與A、B、C組比較，*P<0.01

圖4real-time PCR、Western blotting和免疫組織化學法分別檢測各組瘤組織中

E-cadherin mRNA和蛋白表達以及E-cadherin陽性細胞百分比的結果

圖5　各組瘤組織Western blotting檢測結果

圖6　免疫組織化學法分析E-cadherin陰性細胞(×200)

3討論

1.3.4肝內腫瘤體積變化分別于術后7、14、21 d進行磁共振掃描，記錄肝內腫瘤體積。腫瘤體積(V)=最大徑(a)×最小徑(b)2/2。

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有學者[9]給予肝癌動物模型肝動脈結扎模擬TAE治療，發(fā)現TAE治療促進了肝癌細胞的肺轉移。這可能是，一方面，結扎肝動脈阻斷腫瘤血供，使營養(yǎng)供給缺乏和分解代謝產物積聚，并在氧自由基的作用下腫瘤細胞壞死；另一方面，肝動脈結扎后，肝外的側枝血管迅速開放，從而導致缺血再灌注損傷，造成腫瘤假性包膜結構的破壞，使腫瘤細胞突破包膜向周圍肝實質浸潤。同時，血液循環(huán)恢復后，殘余有活力的腫瘤細胞再生增殖能力加強，使惡性程度增加。我們進行的栓塞治療是經微導管超選擇進入腫瘤血管的，注入碘油及微球等栓塞劑使腫瘤灶致密填塞，使其缺氧壞死，而且不易形成側枝循環(huán)。但小劑量碘油栓塞會致腫瘤周邊的包膜被破壞，使腫瘤細胞脫落，而且腫瘤細胞沒有受到有效打擊，大部分仍然存活，侵襲能力甚至較前更強，從而使瘤細胞更易入血，造成遠處轉移。本研究亦發(fā)現，大劑量碘油栓塞相對于小劑量碘油栓塞、肝動脈結扎治療肝癌，TAE術后肺轉移結節(jié)的個數減少，說明采用大劑量碘油進行栓塞治療，對肺轉移的進展有一定的抑制作用。

首先，不夠重視識字課堂學習。當前，在小學語文識字教學中，眾多的語文教師往往采取的都是常規(guī)的上課教學模式，都是希望通過講解生字的音、形、義來教會學生識字，恰巧忽略了學生的興趣培養(yǎng)，更沒有適當發(fā)揮學生的創(chuàng)造力和想象力，從而讓我們的識字課堂變得千篇一律，學生感覺枯燥乏味，漸漸地就成了完成任務式識字，這樣當然不能提高識字能力。

腫瘤的進展是一個十分復雜的生物學過程。首先，腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落，侵襲基底膜，侵入血管、淋巴管等，其中少數腫瘤細胞在脫落、侵襲過程中存活下來，并隨血流、淋巴流游走到其他部位；然后，這種具有轉移潛能的腫瘤細胞與靶器官的血管壁黏附，進而穿出血管形成微小轉移灶，繼續(xù)增殖形成與原發(fā)瘤同樣類型的腫瘤。這些腫瘤生長后繼續(xù)侵襲和轉移。這個過程中涉及生長因子、黏附分子及細胞外基質、血管生成、機體免疫等多個環(huán)節(jié)，其中細胞黏附是一個重要環(huán)節(jié)。

E-cadherin屬于Ⅰ型鈣黏素家族的跨膜糖蛋白，其分子結構主要包括細胞外肽段、跨膜區(qū)和相對較小的細胞內肽段，通過catenins與肌動蛋白骨架連接，介導細胞間的黏附。E-cadherin不僅介導細胞間的黏附，而且也是胞外-胞內骨架轉導通路上的關鍵分子，其結構改變或數量增減均影響細胞分化和組織形態(tài)。E-cadherin在癌細胞中普遍低表達、缺失或突變，與腫瘤細胞喪失接觸抑制相關，是一種抑癌基因；其表達下降，導致細胞黏附性減弱，使腫瘤細胞播散、轉移。E-cadherin在肝癌組織中的表達與肝癌的侵襲轉移呈負相關，表達越低，肝癌侵襲轉移的可能性越大。有學者[10]報告，將含小鼠E-cadherin cDNA的質粒導入缺失E-cadherin的高侵襲性細胞系，篩選出高水平穩(wěn)定表達該cDNA的轉染細胞進行觀察，結果顯示其侵襲性消失。本研究在術后21 d處死所有大鼠，并檢測了肝腫瘤組織中的E-cadherin的表達情況，發(fā)現大劑量碘油栓塞組的E-cadherin的表達高于其他3組，且腫瘤肺轉移數少。

本研究還發(fā)現大劑量碘油栓塞組大鼠術后體質量降低、活動能力等較差。這可能是由于在大鼠肝癌模型上難以做到真正的超選擇栓塞，碘油會進入正常肝組織，使其受損，導致肝功能下降。因此，在臨床進行TACE時，要做到超選擇栓塞，以保護正常肝組織。

綜上所述，本研究通過對大鼠肝癌模型行TAE和肝動脈結扎治療，發(fā)現大劑量碘油栓塞治療能夠抑制腫瘤生長、降低腫瘤肺轉移，其機制有待研究。

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Expression of E-cadherin in Rat Model of Hepatic Carcinoma during Transarterial Embolization and Its Relationship with Pulmonary Metastasis

ZHANGWeiQIANShengQUXudongZHULiangZHOUBoYANGGuoweiWANGJianhuaLIURongYANZhipingDeptartmentofInterventionalRadiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To conduct transarterial embolization(TAE) in rat model of hepatic carcinoma and to investigate the effect of embolization on pulmonary metastasis and expression of E-cadherin. Methods: Forty Buffalo rats were chosen and rat models of hepatic carcinoma with stable expression of green fluorescent protein(EGFP) were established.Rats were randomly divided into four groups with 10 rats in each group.The control group(Group A) were treated with 0.2 mL of 0.9% sodium chloride solution by gastroduodenal artery retrograde catheterization. The hepatic artery ligation group(Group B) were treated with suture ligation after separation of hepatic artery. The low dose embolization group(Group C) were treated with lipiodol ultrafluide(0.2 mL/kg) by gastroduodenal artery retrograde catheterization. The high dose embolization group(Group D) were treated with lipiodol fluide(0.4 mL/kg) by gastroduodenal artery retrograde catheterization.Body weights,tumor volumes were evaluated after operation. At 21 d after operation, the rats were killed and the samples of liver and lung were collected. The changes of tumor growth and the situations of pulmonary metastasis were evaluated. The changes in E-cadherin mRNA and protein expression levels were detected by real-time fluorescent quantitative PCR,Western blotting and immunohistochemistry. Results: At 21 d after operation,the hepatic tumor growth was obviously inhibited in Group D, and the tumor growth in Group B or Group C was also inhibited while compared with that in Group A(P<0.01).The number of pulmonary metastasis in Group D was lower than those in the other groups(P<0.01).The levels of E-cadherin mRNA and protein in Group D were higher than those in the other groups and the differences were statistically significant(P<0.01). The rate of E-cadherin-positive cells in Group D were higher than those in the other groups according to immunohistochemistry, and the differences were statistically significant(P<0.01). Conclusions: TAE, in the treatment of hepatic carcinoma on the rat models, can promote E-cadherin expression, and high dose lipiodol embolization can inhibit tumor growth and reduce pulmonary metastasis.

Key WordsHepatic carcinoma；Embolization；Rat；Pulmonary metastasis；E-cadherin

通訊作者劉嶸，E-mail：liu.rong@zs-hospital.sh.cn

中圖分類號R81

文獻標識碼A