殷　勤，肖安風(fēng),2,3,4，朱艷冰,2,3,4，蔡慧農(nóng),2,3,4，倪 輝,2,3,4，楊秋明,2,3,4

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，

福建 廈門 361021；3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；

4.廈門南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021)

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酶解龍須菜粗多糖硫酸基工藝優(yōu)化

殷勤1，肖安風(fēng)1,2,3,4，朱艷冰1,2,3,4，蔡慧農(nóng)1,2,3,4，倪 輝1,2,3,4，楊秋明1,2,3,4

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，

福建 廈門 361021；3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；

4.廈門南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021)

[摘要]為探索重組芳香基硫酸酯酶水解龍須菜粗多糖的動態(tài)過程變化，同時為重組酶的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以pET-28a為表達(dá)載體，在大腸桿菌(E.coli)中誘導(dǎo)表達(dá)獲得能特異性水解硫酸酯的重組芳香基硫酸酯酶.并利用重組芳香基硫酸酯酶水解海藻龍須菜中的硫酸基團(tuán)，以硫酸基含量和硫酸基脫除率為指標(biāo)，利用單因素試驗研究各因素對龍須菜粗多糖硫酸基水解過程的影響.試驗確定了脫除龍須菜粗多糖硫酸基團(tuán)的工藝條件，結(jié)果表明，重組芳香基硫酸酯酶水解龍須菜粗多糖的適宜工藝條件為：水解溫度40 ℃，pH值7.0，初始底物5 g/L，加酶量108.14 U，振蕩速率120 times/min，酶解反應(yīng)2 h，在此工藝條件下脫除了78.4%的硫酸基團(tuán)，凝膠強(qiáng)度提高2.1倍，凝固溫度、融化溫度分別為38.4 ℃和91.3 ℃.重組芳香基硫酸酯酶在酶解過程中水解龍須菜粗多糖中硫酸酯表現(xiàn)出較高的活力.

[關(guān)鍵詞]重組；芳香基硫酸酯酶；酶解；工藝；龍須菜；粗多糖；硫酸基

0引言

瓊脂是來源于紅藻類海藻細(xì)胞壁的天然有機(jī)多糖膠體，由70%瓊脂糖和30%瓊脂果膠(質(zhì)量分?jǐn)?shù))構(gòu)成.瓊脂糖是由(1-3)-β-D-半乳糖和(1-4)-3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖組成的鏈狀聚合物，而瓊脂果膠的結(jié)構(gòu)則比較復(fù)雜，其主要結(jié)構(gòu)與瓊脂糖相同，只是(1-4)-3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖上的羥基易被硫酸基、甲氧基、丙酮基等基團(tuán)替代.瓊脂中的這些基團(tuán)會影響分子間交聯(lián)，從而降低瓊脂的凝膠強(qiáng)度[1-2].凝膠強(qiáng)度是衡量瓊脂產(chǎn)品品質(zhì)的主要指標(biāo)，硫酸基團(tuán)是阻礙瓊膠分子形成凝膠的關(guān)鍵因素.瓊脂作為凝固劑、穩(wěn)定劑、藥膏基材和瞬時吸收劑等在食品工業(yè)、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[3-5].目前瓊脂工業(yè)生產(chǎn)中普遍使用堿法去除海藻原料中的硫酸酯基團(tuán)[6].堿法處理工藝不僅產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)保問題，還會導(dǎo)致瓊脂大量降解流失[7].與堿處理工藝相比，采用酶水解技術(shù)去除瓊脂中的硫酸酯基團(tuán)具有反應(yīng)條件溫和、特異性高的特點，減少了產(chǎn)品污染和化學(xué)排放，而且可提高瓊脂產(chǎn)品質(zhì)量，是新型瓊脂生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展方向.

近年來，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，來自Sphingomonassp.AS6330、Pseudoalteromonascarrageenovora、Pyrococcusfuriosus和Thermotogamaritima等少數(shù)微生物的芳香基硫酸酯酶(arylsulfatase，EC 3.1.6.1)具有瓊脂硫酸酯水解活性，Kim等[8]2004 年篩選到一株產(chǎn)芳香族硫酸酯酶的菌株Sphingomonassp.AS6330，該酶能降解瓊脂、巖藻糖、卡拉膠等多種海藻多糖上的硫酸基團(tuán)，且對瓊脂的脫硫效果最好，能水解瓊脂上97.7%的硫酸根，經(jīng)酶處理后凝膠強(qiáng)度可提升2.44倍；Lim等[9]2004年利用異源表達(dá)的方法，在大腸桿菌中成功表達(dá)了Pseudomonascarrageenovora菌株中的芳香族硫酸酯酶，純化后的重組芳香基硫酸酯酶與瓊脂反應(yīng)后，瓊脂凝膠強(qiáng)度增加了2倍，73%的硫酸根被去除；Jung等[10]2011年將Pyrococcusfuriosus中芳香基硫酸酯酶基因克隆并在大腸桿菌中表達(dá)，純化后的重組芳香基硫酸酯酶可以脫除75%的硫酸基；Lee等[11]2013年將Thermotogamaritima中的芳香基硫酸酯酶克隆并在大腸桿菌中表達(dá)，重組芳香基硫酸酯酶脫除了瓊脂中60%的硫酸基.

在前期研究中，本課題組成功克隆芳香基硫酸酯酶基因并在大腸桿菌(E.coliBL21 (DE3))中表達(dá)，得到重組芳香基硫酸酯酶(recombinant arylsulfatase)，該酶具有水解人工底物對硝基苯硫酸鉀(p-NPS)和脫除龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)粗多糖硫酸基團(tuán)的活力.本文在前期工作基礎(chǔ)上，通過單因素試驗優(yōu)化酶法脫除龍須菜粗多糖硫酸基團(tuán)的條件，得出了適合龍須菜粗多糖脫硫的相關(guān)工藝參數(shù)，完善了脫硫工藝.通過調(diào)整相關(guān)工藝參數(shù)，有效地提高了重組芳香基硫酸酯酶脫除硫酸基團(tuán)的功能效果，降低了脫硫成本，為實現(xiàn)酶法脫除硫酸基團(tuán)輔助提取瓊脂的研究積累了實踐資料.

1材料與方法

1.1　材料與試劑

重組芳香基硫酸酯酶：將來源于假交替單胞菌(Pseudoalteromonas carrageenovora)Ary987 的芳香基硫酸酯酶基因(GenBank:KJ509595)克隆、表達(dá)至大腸桿菌(E.coli)中，發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌獲得重組芳香基硫酸酯酶，收集發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體，復(fù)溶后用低溫超聲波破碎細(xì)胞，再冷凍離心后收集上清液，經(jīng)Ni-NTA純化后獲得重組芳香基硫酸酯酶，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測得蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.27 mg/mL，酶的比活力為26.7 U/mg (酶活力U定義：在一定條件下，每分鐘催化生成1 μmoL 對硝基苯酚(p-NP)所需的酶量).龍須菜購于福建廈門集美菜市場.硫酸鉀、鹽酸、氯化鋇、吐溫-80、無水乙醇、氫氧化鈉等均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司.

1.2　儀器與設(shè)備

UV-2600A紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；ZHWY-2012雙層全溫度恒溫?fù)u床(上海智誠實驗設(shè)備有限公司)；BS223S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；Minispin 高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；LDZX-40KAS立式高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠).

1.3　方法

1.3.1龍須菜粗多糖的制備

取100 g的龍須菜剪成1~2 cm小段，加入100 mL水，在80 ℃水浴2 h，加入300 mL沸水，置于高壓滅菌鍋中，在0.12 MPa、121 ℃保持30 min，用8層紗布過濾，濾液冷卻后稱重，于-20 ℃冷凍完全后，加入1.5倍體積的95%乙醇(體積分?jǐn)?shù))融化脫水，用85%乙醇(體積分?jǐn)?shù))浸泡后，于50 ℃烘干，粉碎，制得龍須菜粗多糖干粉，備用.

1.3.2單因素試驗優(yōu)化重組芳香基硫酸酯酶脫除龍須菜粗多糖硫酸基團(tuán)

稱取一定量的龍須菜粗多糖干粉用50 mmol/L Tris-HCl (pH=7.0)緩沖液配制成5 g/L龍須菜粗多糖溶液，加入重組芳香基硫酸酯酶酶液在一定溫度下水浴振蕩2 h，每15 min取樣測定硫酸基團(tuán)含量.在保持其他條件不變的情況下分別改變底物濃度、pH值、加酶量、溫度、振蕩速率進(jìn)行單因素試驗.

1.3.3檢測指標(biāo)

1)硫酸基含量的測定：參照文獻(xiàn)[12]測定樣品硫酸基含量.

2)凝膠強(qiáng)度的測定：參照國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑瓊脂GB 1975—2010[13]測定樣品凝膠強(qiáng)度(g/cm2).

3)凝固溫度和融化溫度的測定：參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行.

4)硫酸基脫除率的計算:硫酸基脫除率/%=[(總硫酸基含量-游離硫酸基含量)/總硫酸基含量]×100.

2結(jié)果與分析

2.1　單因素試驗結(jié)果

2.1.1底物濃度對重組芳香基硫酸酯酶脫除硫酸基團(tuán)的影響按照1.3.2的條件，分別考察不同底物濃度下重組芳香基硫酸酯酶水解龍須菜粗多糖的過程變化，結(jié)果如圖1所示.可見，底物硫酸基含量隨著底物濃度的增加而減小，而硫酸基脫除率則上升.在底物濃度較低時，反應(yīng)體系均勻，不易凝固，產(chǎn)物易于擴(kuò)散到溶液中，故在一定的底物濃度范圍內(nèi)，保持殘留硫酸基含量隨著底物濃度的增加而減小、硫酸基脫除率上升的趨勢.底物濃度過高，酶量達(dá)到飽和且隨反應(yīng)時間的延長致龍須菜粗多糖凝固等因素影響酶解效率，故硫酸基含量及硫酸基脫除率趨于穩(wěn)定.從酶解龍須菜粗多糖的轉(zhuǎn)化率及底物利用效率角度考慮，選取質(zhì)量濃度為5 g/L的龍須菜粗多糖為底物時較佳.

2.1.2pH值對重組芳香基硫酸酯酶脫除硫酸基團(tuán)的影響來源于細(xì)菌的芳香基硫酸酯酶，有些最適pH值為6.5~7.1，有些最適pH值為8.3~9.0[14]，Salmonellatyohimurium的芳香基硫酸酯酶最適pH值為6.7[15]，如Pseudomonasaeruginosa的芳香基硫酸酯酶最適pH值為8.9[16].按照1.3.2的條件，分別考察不同pH值下重組芳香基硫酸酯酶水解龍須菜粗多糖的過程變化，結(jié)果如圖2所示.結(jié)果表明，重組芳香基硫酸酯酶對pH值的變化不敏感，在待測的pH值條件下均呈現(xiàn)硫酸基團(tuán)含量逐漸減小、硫酸基脫除率逐漸增加的趨勢，且在pH=7.0時，硫酸基團(tuán)含量降至最低，硫酸基脫除率達(dá)到最高，故確定重組芳香基硫酸酯酶酶解龍須菜粗多糖的最適pH值為7.0.

2.1.3加酶量對重組芳香基硫酸酯酶脫除硫酸基團(tuán)的影響如圖3，在加酶量小于108.14 U時，隨著重組芳香基硫酸酯酶用量的增加，硫酸基含量減小及硫酸基脫除率逐漸增加，當(dāng)加酶量大于108.14 U時，重組芳香基硫酸酯酶用量的增加對硫酸基含量及硫酸基脫除率沒有明顯影響.其原因主要是酶與底物的吸附作用有一定的飽和度，當(dāng)酶過量時酶與底物結(jié)合飽和，再增加酶量，水解反應(yīng)速率不再提高.從節(jié)約生產(chǎn)成本降低能耗角度考慮，最適酶用量為108.14 U，在此條件下，硫酸基脫除率在反應(yīng)30 min后增加至69.1%，此后硫酸基脫除率變化不大.

2.1.4溫度對重組芳香基硫酸酯酶脫除硫酸基團(tuán)的影響如圖4，當(dāng)酶反應(yīng)溫度小于40 ℃或大于40 ℃時，隨著溫度的升高，都呈現(xiàn)硫酸基含量減小及硫酸基脫除率增加的趨勢；在40 ℃時硫酸基含量最低、硫酸基脫除率達(dá)到最高.此外，還可以發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)的前30 min，50 ℃時的硫酸基含量及硫酸基脫除率要高于40 ℃時的硫酸基含量及硫酸基脫除率，這說明相比于40 ℃，重組芳香基硫酸酯酶在50 ℃時雖然活力更高，但更易失活，從而導(dǎo)致50 ℃條件下硫酸基含量及硫酸基脫除率反而小于40 ℃.在40 ℃的反應(yīng)條件下，硫酸基脫除率在反應(yīng)45 min后率先增加至58.7%，因此確定酶水解最適溫度為40 ℃.

2.1.5振蕩速率對重組芳香基硫酸酯酶脫除硫酸基團(tuán)的影響振蕩可增加酶與底物接觸的機(jī)會，加速酶促反應(yīng)的進(jìn)行，且龍須菜粗多糖樣品易于凝固，更應(yīng)在反應(yīng)時加以振蕩，以保證酶促反應(yīng)的催化效率及底物轉(zhuǎn)化率.分別考察不同振蕩速率下重組芳香基硫酸酯酶水解龍須菜粗多糖的動態(tài)過程變化，如圖5，當(dāng)振蕩速率為160 times/min時，硫酸基含量最低及硫酸基脫除率最高，但與120 times/min的結(jié)果相差不大，為降低能耗，故選擇120 times/min為宜.

2.2　酶解產(chǎn)物凝膠強(qiáng)度、凝固溫度和融化溫度的測定

由于瓊膠分子的結(jié)構(gòu)差異，如硫酸基的含量與結(jié)合位置不同，以及甲氧基、丙酮酸的含量不同等，分子質(zhì)量和純度的不同所生成的凝膠表現(xiàn)出的彈性強(qiáng)度有明顯的差別，這種彈性強(qiáng)弱以凝膠強(qiáng)度(gel strength)表示.參照文獻(xiàn)[13]的方法，在單因素優(yōu)化后的實驗條件下，將酶與底物反應(yīng)后的產(chǎn)物用于測量龍須菜粗多糖的凝膠強(qiáng)度.瓊膠具有溶膠和凝膠的可逆反應(yīng)特性，因而表現(xiàn)兩種形態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，即凝固溫度和融化溫度.酶處理組和空白組的凝膠強(qiáng)度、凝固溫度、融化溫度、基質(zhì)含量、硫酸基脫除率的測定結(jié)果分別為：428 g/cm2，38.4 ℃，91.3 ℃，2.883 μg/mg，78.4%；205 g/cm2，40.7 ℃，90.5 ℃，13.372 μg/mg，1.2%.經(jīng)酶處理后的龍須菜粗多糖凝膠強(qiáng)度比空白組提高了2.1倍.

3結(jié)論

本試驗用單因素試驗的方法，對重組芳香基硫酸酯酶脫除龍須菜粗多糖硫酸基的酶促反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后最佳的反應(yīng)條件為：底物質(zhì)量濃度5 g/L，pH值為7.0，加酶量40%，溫度40 ℃，振蕩速率120 times/min，在該條件下反應(yīng)后酶解產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度達(dá)428 g/cm2，比空白組提高了2.1倍，脫除了78.4%的硫酸基，凝固溫度為38.4 ℃，融化溫度為91.3 ℃.

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(責(zé)任編輯馬建華英文審校曹敏杰)

Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Sulfate in Crude Polysaccharidefrom Gracilaria lemaneiformis by Recombinant Arylsulfatase

YIN Qin1,XIAO An-feng1,2,3,4,ZHU Yan-bing1,2,3,4,CAI Hui-nong1,2,3,4，NI Hui1,2,3,4,YANG Qiu-ming1,2,3,4

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;

2.Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering,Xiamen 361021,China;

3.Research Center of Food Biotechnology of Xiamen,Xiamen 361021,China;4.Key Laboratory of Recycling Application

and Deep Processing in Economic Marine Alga,Xiamen South Oceanographic Research Center,Xiamen 361021,China)

Abstract:The arylsulfatase gene from a marine aerobic Gram-negative bacterium,Pseudoalteromonas carrageenovora,was cloned into pET-28a vector and expressed in E.coli BL21 (DE3).The technical conditions for sulfate hydrolysis of Gracilaria lemaneiformis by recombinant arylsulfatase were optimized by single factor experiments based on sulfate content and sulfate removal rate.The optimum parameters for sulfate hydrolysis by recombinant arylsulfatase were obtained as substrate concentration of 5 g/L,initial pH of 7.0,enzyme dosage of 108.14 U,at 40 ℃,oscillation rate of 120 times/min and enzymatic duration of 2 h.After crude polysaccharide from Gracilaria lemaneiformis was treated with purified fusion recombinant arylsulfatase for 2 h at 40 ℃,the gel strength of the products increased by 2.1 folds,and 78.4% of the sulfate in the crude polysaccharide was removed.The gelling temperature and melting temperature were 38.4 ℃ and 91.3 ℃,respectively.It was thus expected that the recombinant arylsulfatase could be used for the desulfation of sulfated polysaccharides and applied in the production of low sulfated agar or agarose.

Key words:recombination;arylsulfatase;enzymatic hydrolysis;technology;Gracilaria lemaneiformis;crude polysaccharide;sulfate

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[中圖分類號]Q 814.9

[文章編號]1007-7405(2015)03-0173-06

[作者簡介]殷勤(1990—)，女，碩士生，主要從事食品生物技術(shù)研究.通信作者：楊秋明(1977—)，男，高級實驗師，主要從事食品微生物及工藝方面的研究，E-mail：yangqm@jmu.edu.cn.

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(31401632)；廈門市科技計劃項目(3502Z20120005)；廈門南方海洋研究中心項目(13GZP004NF10)

[收稿日期]2014-11-17[修回日期] 2015-01-23