吳麗云，劉　韓，倪　輝,2,3,4 ,肖安風(fēng),2,3,4，蔡慧農(nóng),2,3,4，朱艷冰,2,3,4

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021； 2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

福建 廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；

4.廈門市南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021)

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Pseudomonassyringae褐藻膠裂解酶基因的克隆及信息學(xué)分析

吳麗云1，劉韓1，倪輝1,2,3,4,肖安風(fēng)1,2,3,4，蔡慧農(nóng)1,2,3,4，朱艷冰1,2,3,4

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021； 2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

福建 廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；

4.廈門市南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021)

[摘要]以Pseudomonas syringae的基因組為模板，使用褐藻膠裂解酶引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的基因克隆至pMD18-T載體后進(jìn)行測序.結(jié)果顯示，克隆基因的大小為1137 bp，預(yù)測編碼含有378個氨基酸殘基的蛋白質(zhì).對該蛋白質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)序列與其他菌株來源的褐藻膠裂解酶具有高的相似性，預(yù)測本研究克隆的基因編碼褐藻膠裂解酶.該褐藻膠裂解酶的理論分子質(zhì)量為42.5 ku，理論等電點(diǎn)為8.15.采用同源建模法建立P.syringae褐藻膠裂解酶的三維結(jié)構(gòu)，富含螺旋結(jié)構(gòu).

[關(guān)鍵詞]假單胞菌;褐藻膠裂解酶;克隆;生物信息學(xué)

0引言

褐藻膠為主要來源于褐藻類植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)多糖，它是一種陰離子酸性直鏈多糖，由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古羅糖醛酸(G)通過共價鍵隨機(jī)結(jié)合形成的線性無支鏈的高分子聚合物[1].褐藻膠來源豐富，以其凝膠性、增稠性、穩(wěn)定性和螯合金屬離子等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、印染和化工等領(lǐng)域[2-4].褐藻膠的降解產(chǎn)物褐藻膠寡糖因其具有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出多種生物活性，例如抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)植物生長等[5-9]. 研究表明，利用褐藻膠裂解酶催化裂解褐藻膠糖苷鍵，從而在非還原端形成具有雙鍵的不飽和糖醛酸寡糖，這種不飽和雙鍵對褐藻膠寡糖所具有的生理活性功能有重要的影響[10].根據(jù)褐藻膠裂解酶的底物專一性，褐藻膠裂解酶分為多聚β-D-1,4-甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)和多聚α-L-1,4-古羅糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11).已經(jīng)報道的褐藻膠裂解酶的來源主要包括海洋藻類、海洋軟體動物、棘皮動物和微生物(包括海洋細(xì)菌、陸生真菌和極少數(shù)的病毒)，其中細(xì)菌類是褐藻膠裂解酶研究最為廣泛的來源[11-14].利用基因工程技術(shù)將褐藻膠裂解酶基因在工業(yè)化生產(chǎn)的宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，以獲得高產(chǎn)量、高純度、高活性、高穩(wěn)定性的褐藻膠裂解酶制劑，具有高的產(chǎn)業(yè)潛力. 本文進(jìn)行Pseudomonassyringae褐藻膠裂解酶基因的克隆及其生物信息學(xué)分析，為該菌株褐藻膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)、酶的結(jié)構(gòu)與功能研究奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1　材料

P.syringae購自德國微生物菌種保藏中心(No.21482)，E.coliDH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存.pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA標(biāo)準(zhǔn)均為TaKaRa公司產(chǎn)品，T4DNA連接酶為Fermentas公司產(chǎn)品，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，柱式質(zhì)粒DNA提取試劑盒和柱式DNA膠回收試劑盒均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品，寡核苷酸序列的合成及核酸序列的測定均委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成，其余試劑均為分析純產(chǎn)品.

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1褐藻膠裂解酶的活力測定

將P.syringae接種于培養(yǎng)基(0.25% D-葡萄糖，0.3%大豆蛋白胨，1.7%干酪素，0.5% NaCl，0.25% K2HPO4，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，25 ℃培養(yǎng)36 h后，取20 mL培養(yǎng)液于4 ℃、10000 r/min離心10 min，收集上清液，即為胞外液.用2 mL 50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH=7.5)重懸菌體，在冰浴條件下超聲破菌后，4 ℃、10000 r/min離心10 min，獲得上清液，即為胞內(nèi)液.取0.25 mL含0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))褐藻膠的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH=7.5)，加入0.25 mL粗酶液，30 ℃反應(yīng)30 min后，沸水終止反應(yīng).加入0.5 mL DNS試劑，混勻后于540 nm波長下測定反應(yīng)液的吸光度值.通過制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定還原糖含量，根據(jù)還原糖的產(chǎn)生計(jì)算褐藻膠裂解酶的活力.褐藻膠裂解酶活力定義為：在上述條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μg還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量為1個酶活力單位(U).

1.2.2褐藻膠裂解酶基因的克隆

根據(jù)GenBank中P.syringae的褐藻膠裂解酶基因序列，合成以下引物，P1:5′-ATGCAGACTCCTAAACTGAT-3′，P2:5′-TCACGAACCGTCGTTATCGC-3′.利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取P.syringae的基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃，90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測后，凝膠回收目的基因片段.將回收產(chǎn)物與T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞.細(xì)胞涂布在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)平板上(平板上預(yù)先涂布10 μL 0.5 mol/L IPTG和50 μL 20 mg/mL X-gal).從平板挑選白色單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定重組子，并經(jīng)測序鑒定重組質(zhì)粒中的插入序列.

1.2.3基因及其編碼產(chǎn)物的生物學(xué)信息分析

利用NCBI的BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的同源性搜索，利用MEGA 6.0[15]的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用ExPASy的Protparam工具進(jìn)行蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測.蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SOPMA程序[16]進(jìn)行，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域及信號肽分析利用SMART[17]進(jìn)行.利用SWISS-MODEL[18]進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的三維模建，采用VMD軟件顯示蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu).

2結(jié)果

2.1　褐藻膠裂解酶的活力

采用DNS法測定菌株P(guān).syringae所產(chǎn)的細(xì)胞內(nèi)外褐藻膠裂解酶的活性，結(jié)果顯示，胞內(nèi)粗酶液的活力達(dá)7 U/mL，未檢測到胞外樣品的酶活力.由此可見，菌株P(guān).syringae以胞內(nèi)形式產(chǎn)褐藻膠裂解酶.

2.2　褐藻膠裂解酶基因的克隆

以P.syringae的基因組DNA(見圖1a)為模板，利用褐藻膠裂解酶引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物為大約1100 bp的DNA片段(見圖1b).將該基因克隆入T載體后進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示目的基因的大小為1137 bp.

2.3　褐藻膠裂解酶基因及其編碼產(chǎn)物的序列分析

P.syringae褐藻膠裂解酶基因(1137 bp)預(yù)測編碼378個氨基酸.該蛋白質(zhì)的前28個氨基酸殘基預(yù)測為信號肽，預(yù)測的切割位點(diǎn)位于A28和A29之間.將該蛋白質(zhì)序列在Genbank Reference proteins數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果顯示，目的基因編碼的蛋白質(zhì)序列與來自P.syringae(WP_003365409)、P.amygdale(WP_005752927)、P.savastanoi(WP_002552250)、P.syringae(WP_016567310)、P.syringae(WP_003376044)、P.viridiflava(WP_025994636)和P.syringae(WP_024686395)的多聚β-D-甘露糖醛酸裂解酶或褐藻膠裂解酶的序列分別具有100%、99%、99%、99%、96%、94%和94%的相似性，所以預(yù)測該基因編碼褐藻膠裂解酶.將本研究的P.syringae褐藻膠裂解酶序列與其他菌株來源的褐藻膠裂解酶序列進(jìn)行比對，結(jié)果如圖2所示.N203、H204、R251和Y258構(gòu)成可能的P.syringae褐藻膠裂解酶催化活性位點(diǎn).其中H204位于NNHSYW保守結(jié)構(gòu)中.將本研究的P.syringae褐藻膠裂解酶序列與相似性較高的其他菌株來源的酶序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果(見圖3)顯示，本研究的褐藻膠裂解酶與來自P.syringae的多聚β-D-甘露糖醛酸裂解酶(WP_003365409)聚在一個分支.

2.4　褐藻膠裂解酶基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

利用ExPASy的ProtParam工具分析目的基因所編碼蛋白質(zhì)的序列，結(jié)果如下：氨基酸個數(shù)為378，理論分子質(zhì)量大小為42.5 ku；理論等電點(diǎn)為8.15，負(fù)電荷殘基總數(shù)為50(D+E)，正電荷殘基總數(shù)為52(R+K)；分子式為C1883H2942N522O567S18，原子總數(shù)為5932；預(yù)測在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)半衰期大于10 h，不穩(wěn)定指數(shù)為31.78，該蛋白質(zhì)分類為穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為68.76，親水性平均指數(shù)(Grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.593.

2.5　褐藻膠裂解酶的二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

預(yù)測P.syringae褐藻膠裂解酶的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲所占比例分別為51.59%、7.94%、7.14%和33.33%.該蛋白質(zhì)包含褐藻膠裂解酶結(jié)構(gòu)域，位于64~305位氨基酸殘基.

2.6　褐藻膠裂解酶的三級結(jié)構(gòu)

將P.syringae褐藻膠裂解酶進(jìn)行三維模建，模板來自Sphingomonassp.A1的褐藻膠裂解酶(PDB登錄號為1QAZ).模建的殘基范圍為目的序列中的47~363位氨基酸殘基，在此范圍內(nèi)，目的序列與模板序列的相似性為28%.P.syringae褐藻膠裂解酶富含螺旋結(jié)構(gòu)，由螺旋構(gòu)成的柵狀結(jié)構(gòu)中有個類似隧道的深裂隙(見圖4a).通過與模板序列進(jìn)行比對，N203、H204、R251和Y258組成可能的P.syringae褐藻膠裂解酶催化活性位點(diǎn)[19](見圖4b).一些保守的具有芳香基側(cè)鏈的殘基(W148,W207,Y261和Y258)位于裂隙中，兩個保守的精氨酸殘基(R251和R354)存在于裂隙入口的兩側(cè)(見圖4a).

3討論

本研究中，利用Genbank數(shù)據(jù)庫中已有的P.syringae褐藻膠裂解酶基因序列設(shè)計(jì)引物，從目的菌株的基因組中成功擴(kuò)增了1137bp的基因片段.通過NCBI的蛋白質(zhì)BLAST分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)與Pseudomonas屬中其他菌株來源的褐藻膠裂解酶具有很高的相似性.所以，本研究克隆的基因預(yù)測編碼褐藻膠裂解酶.

褐藻膠裂解酶是多糖裂解酶家族(PLs,EC4.2.2.X)的成員，根據(jù)酶的初級結(jié)構(gòu)可將PLs分為22個家族，褐藻膠裂解酶屬于7個家族，分別為PL-5，PL-6，PL-7，PL-14，PL-15，PL-17和PL-18，大多數(shù)細(xì)菌來源的內(nèi)切褐藻膠裂解酶屬于PL-5和PL-7，而前者多具有降解多聚β-D-甘露糖醛酸底物的特異性，后者多具有降解多聚α-L-古羅糖醛酸底物的特異性[20].研究表明，PL-5和PL-7家族之間的褐藻膠裂解酶序列相似性比較低，然而對催化活性起重要作用的氨基酸，如精氨酸、天冬酰胺(或谷氨酰胺)、組氨酸和酪氨酸都在活性位點(diǎn)的功能區(qū)域[21].本研究中，以Sphingomonassp.A1的褐藻膠裂解酶為模板，將本研究的P.syringae褐藻膠裂解酶進(jìn)行同源模建，它們的三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)相似的空間結(jié)構(gòu).P.syringae褐藻膠裂解酶主要結(jié)構(gòu)為由螺旋構(gòu)成的柵狀結(jié)構(gòu)，類似的結(jié)構(gòu)常見于葡萄糖淀粉酶和纖維素酶[21].這兩個酶的活性中心包括Asn、His、Arg和Tyr，組氨酸位于NNHSYW保守結(jié)構(gòu)中.與Sphingomonassp.A1褐藻膠裂解酶[19]類似，本研究的P.syringae褐藻膠裂解酶結(jié)構(gòu)中也包含一個很深的隧道縫隙，預(yù)測該結(jié)構(gòu)有利于褐藻膠底物分子的滲入，并與酶催化位點(diǎn)相互作用.

P.syringae褐藻膠裂解酶的克隆及生物信息學(xué)分析為該酶的進(jìn)一步研究打下良好的基礎(chǔ).在未來的研究中，可以進(jìn)行P.syringae褐藻膠裂解酶的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究，或進(jìn)一步利用定向進(jìn)化技術(shù)提高該褐藻膠裂解酶的催化活性或熱穩(wěn)定性，為該褐藻膠裂解酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯馬建華英文審校曹敏杰)

Cloning and Bioinformatics Analysis of an Alginate Lyase GenefromPseudomonassyringae

WU Li-yun1,LIU Han1,NI Hui1,2,3,4,XIAO An-feng1,2,3,4,CAI Hui-nong1,2,3,4,ZHU Yan-bing1,2,3,4

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China；

2.Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering of Fujian Province,Xiamen 361021,China；

3.Research Center of Food Biotechnology of Xiamen City,Xiamen 361021,China；4.Key Laboratory of Systemic Utilization

and In-depth Processing of Economic Seaweed,Xiamen Southern Ocean Technology Center of China,Xiamen 361021,China)

Abstract:The genomic DNA of Pseudomonas syringae was used as the template for amplification of alginate lyase gene by PCR using a pair of specific primers.The target gene was cloned into pMD18-T vector and then sequenced.The results showed that the cloned gene was 1137 bp,encoding 378 amino acid residues.This protein was further analyzed by bioinformatics.The results showed that the target protein sequence shared high identities with the alginate lyase sequences from other bacterial strains.So the cloned gene was predicted to be an alginate lyase.The theoretical molecular weight and pI of the alginate lyase were 42.5 ku and 8.15,respectively.The three-dimensional structure of P.syringae the alginate lyase was constructed by homology modeling and presented α-helix rich structure.

Key words:Pseudomonas sp.；alginate lyase；cloning；bioinformatics

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[中圖分類號]Q 939.97

[文章編號]1007-7405(2015)03-0179-07

[作者簡介]吳麗云(1989―)，女，碩士生，從事微生物學(xué)方向研究.通信作者：朱艷冰(1976―)，女，副教授，從事海洋分子生物學(xué)方向研究，E-mail：yanbingzhu@163.com.

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31401632)；廈門南方海洋研究中心項(xiàng)目(13GZP004NF10)；福建省優(yōu)良品種同生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(M20130905)

[收稿日期]2014-10-08[修回日期] 2014-11-15