沈笑然，袁　慧

(首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院 檢驗科，北京 100020)

基于Activin A途徑的大黃素神經(jīng)保護機制的研究

沈笑然，袁慧*

(首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院 檢驗科，北京 100020)

摘要：目的明確大黃素對缺血缺氧性腦損傷中的神經(jīng)元具有保護作用的內(nèi)在機制。方法應用pc-12細胞經(jīng)牛膝多肽刺激轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞后，并制備神經(jīng)元細胞的氧糖剝奪(OGD)模型，并在此基礎(chǔ)上，給予大黃素干預，分別檢測細胞的生存力；應用酶聯(lián)免疫方法檢測細胞培養(yǎng)基的Activin A的表達含量；應用Western blotting 對caspase-3蛋白的檢測。結(jié)果pc-12細胞經(jīng)牛膝多肽刺激后轉(zhuǎn)化為類神經(jīng)元樣細胞，在OGD后的pc-12細胞呈明顯的梯度變化；實驗組細胞的生存力明顯提高，其培養(yǎng)基的Activin A含量升高明顯，caspase-3蛋白的表達與單純應用氧糖剝奪組比較，表達降低(P<0.05)。結(jié)論大黃素可以提高缺血缺氧狀態(tài)下神經(jīng)元細胞的生存力，同時可促進激活素的表達上調(diào)，并通過下調(diào)caspase3表達來抑制神經(jīng)凋亡，起到神經(jīng)保護的作用。

關(guān)鍵詞：OGD;神經(jīng)保護(Neuroprotection);Emodin;Activin A； Apoptosis;Caspase-3

(ChinJLabDiagn,2015,19:1818)

目前，關(guān)于神經(jīng)缺血缺氧腦損傷的發(fā)病過程與機制并不完全明了，而在臨床實踐中，腦保護的治療相對較少。大黃素，作為一種中藥的提取物，其現(xiàn)代研究具有較多的生物學功能，如抗氧化[1]、抗腫瘤[2]等，此外，國內(nèi)外研究表明：大黃素與TGF-β1[3]、Rho激酶[4]等諸多信號轉(zhuǎn)導通路相互作用影響。近年來研究顯示：大黃素還具有明顯的神經(jīng)保護的作用，與腦缺血關(guān)系密切，在神經(jīng)系統(tǒng)腦保護機制的研究中，其是如何發(fā)揮腦保護作用，是否與神經(jīng)保護的相關(guān)的信號途徑相聯(lián)系，我們尚不可知。而激活素A(Activin A)作為神經(jīng)系統(tǒng)中目前公認的強保護因子而備受關(guān)注，研究顯示：其作用機制是以Activin A/Samds 信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)途徑發(fā)揮生物學效應的，推測大黃素對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用可能與激活素A信號系統(tǒng)存在某種關(guān)聯(lián)，本研究就其二者與腦保護的關(guān)系進行更深入的研究[5]。

1材料與方法

1.1材料pc-12細胞，購自北京金紫荊生物有限公司。

1.2方法

1.2.1分組模型制備分組：根據(jù)3 h、6 h、9 h、12 h、16 h、24 h將細胞隨機分為6組進行評價。實驗分為正常對照組(Control組：C組)：正常培養(yǎng)的pc12細胞；氧糖剝奪組(OGD6 h組：O組)：正常培養(yǎng)的pc12細胞行氧糖剝奪處理后6 h；實驗組即大黃素預處理后行OGD實驗組(Emodin組：E組)：應用20 μmol/ml大黃素預處理24 h后行OGD處理6 h。

1.2.2牛膝多肽誘導PC12細胞轉(zhuǎn)化為類神經(jīng)元樣細胞牛膝多肽用DMEM培養(yǎng)基配制成0.5 mg/ml的液體進行pc-12細胞的轉(zhuǎn)換類神經(jīng)元樣細胞的培養(yǎng)。

1.2.3類神經(jīng)元樣細胞的鑒定將細胞爬片的玻片放置在24孔板中，將pc-12細胞按5×104/ml密度接種于孔板中，培養(yǎng)24 h，加入含有0.5 mg/ml牛膝多肽的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，突起長度如果超過細胞體的2倍以上視為陽性，多突起的細胞液可視為陽性，記5孔取平均值。

1.2.4MTT法細胞存活率檢測收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100 μl，鋪板使待測細胞調(diào)密度5×104/ml /孔。5%CO2，37℃孵育，孵育48小時后每孔加入20 μlMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，搖床振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。按公式計算細胞存活率。

1.2.5ELISA法檢測ActinA濃度實驗流程圖按說明書操作。實驗重復3次。

2結(jié)果

2.1PC12細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的鑒定

應用牛膝多肽刺激PC12細胞培養(yǎng)24h，可見細胞長出突觸；牛膝多肽刺激36h，細胞突起變長；培養(yǎng)72h，突觸與突觸之間互相交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有的神經(jīng)元形態(tài)特點，占總數(shù)90%以上。見圖1。

A：牛膝多肽刺激24 h；B：牛膝多肽刺激36 h；C：牛膝多肽刺激72 h，呈典型神經(jīng)元形態(tài)

2.2PC-12細胞氧糖剝奪(OGD)模型的評價

氧糖剝奪不同時間MTT法細胞存活率檢測，OGD3h細胞存活率較正常對照組略開始有所降低87.31%，到24h其生存活力不到10%，期間，12h出現(xiàn)一個陡直的下降；OGD3h—OGD12h時細胞存活率呈現(xiàn)緩坡狀；OGD12h與OGD24h細胞存活率與對照組及OGD3h組比較差異顯著(P<0.05)。各組細胞存活率見圖2。

2.3行大黃素預處理后MTT法檢測細胞生存活力

與對照組相比，行OGD6h組的細胞生存力明顯下降，具有統(tǒng)計學意義，應用大黃素處理以后再行OGD6h組，其生存活力較OGD6h組明顯改善，具有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4酶聯(lián)免疫法檢測激活素A的含量

在對照組的培養(yǎng)基中，可以檢測出微量的ActivinA的分泌，行OGD的pc-12細胞培養(yǎng)液中ActivinA的含量與對照組相比，有明顯的升高，經(jīng)過大黃素與處理的pc-12細胞組中，與OGD組相比，Actin有著較顯著的升高(P<0.05)，見圖4。

*與Control組比較P<0.05，△與OGD3h組比較P<0.05

*與Control組比較P<0.05，△與OGD6h組比較P<0.05

*與Control組比較P<0.05，△與OGD6h組比較P<0.05

2.5westernblotting法檢測caspase-3蛋白的表達

應用OGD后6h，檢測到有caspase3的前體蛋白(procaspase3)和裂解蛋白(leavedcaspase3)的高表達，其差異顯著(P<0.05)；應用大黃素預處理后，再行氧糖剝奪的pc-12細胞的cleavedcaspase3蛋白表達較單純氧糖剝奪組明顯減低(P<0.05)。見圖5、圖6。

*與Control組比較P<0.05，△與OGD6h組比較P<0.05

3討論

現(xiàn)代研究顯示:激活素A具有神經(jīng)保護的作用[6,7]。而大黃素作為從中藥大黃中提取的一種有效單體，具有較多的生物學活性，大黃素通過抗氧化和抑制谷氨酸鹽毒性作用，起到神經(jīng)保護作用，對抗大腦的缺血性再灌注損傷[8,9]。同時研究還顯示：大黃素可使損傷后組織細胞的凋亡率明顯下降[10]。

圖6　應用大黃素后caspase-3 Protein的檢測

本實驗中，我們采用大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12細胞株)，其在體外可經(jīng)牛膝多肽刺激誘導后，可向神經(jīng)元分化，轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細胞。并制備OGD模型，采用MTT、hoechst熒光染色等技術(shù)進行模型評價，結(jié)果顯示在體外制備缺血缺氧細胞模型建立成功。

正如實驗結(jié)果顯示，應用大黃素預培養(yǎng)后，再行氧糖剝奪的pc-12細胞組(E組)與OGD6h組(O組)比較，生存力升高明顯，說明大黃素可以在體外明顯提高神經(jīng)元在缺血缺氧的腦損傷中的耐受力和生存力。同時發(fā)現(xiàn)：在pc-12細胞經(jīng)大黃素預處理后行氧糖剝奪組的培養(yǎng)基中可見激活素的高表達，提示：大黃素可能通過某種途徑預先激活神經(jīng)元細胞的某種自身保護機制，使神經(jīng)元細胞對激活素的表達上調(diào)。推測大黃素可能預先通過某種潛在的靶點激活了ActivinA/Smads信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，通過某種正反饋機制不斷自分泌激活素A蛋白，強化了神經(jīng)元細胞抗損傷的能力。

本研究中，應用大黃素預處理后，再行氧糖剝奪的pc-12細胞的caspase3的裂解蛋白(cleavedcaspase3)和前提蛋白(procaspase-3)表達較單純氧糖剝奪組表達明顯減低。提示大黃素神經(jīng)保護作用的發(fā)揮，或是通過對抗損傷后細胞凋亡的作用而實現(xiàn)的。

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Research of neuroprotection mechanism of emodin by Actin A pathwaySHENXiao-ran,YUANHui.(DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingAnzhenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijng100020,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate effect and possible mechanism of neuroprotection of emodin in ischemia brain injuries.MethodsPC12 cells were transformed into neurons which had been stimulated by polypeptides of achyranthes bidentata blume(ABPP) in vitro.Oxygen and glucose deprivation (OGD) model of activated PC 12 cells prepare were established in extracellular environment without oxygen and nutrition.Viability ere detected after OGD injury.expression of Actin A were measured with ELISA.Protein expression of caspase-3 were detected with Western blotting.ResultsPC12 cells were transformed into neuron-like cells which had been stimulated by ABPP in vitro.Change of ladder of Viability were detected after OGD injury.Contrast with group O,Viability rised significantly in group E,and content of Actin A in nutrient medium increased obviously.Compared with group O,caspase-3 protein expression detected by western blotting reduced significantly (P).ConclusionEdomin can enhance Viability of pc-12 cells after OGD,and promote expression of Actin A,upgrade the protein expression of caspase -3 and inhabin apoptosis.

Key words:OGD;Neuroprotection;Emodin;Actin A；Apoptosis;Caspase-3

(收稿日期：2014-11-22)

作者簡介：沈笑然，女，碩士研究生，臨床檢驗師，研究方向：細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)研究。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R54

文章編號：1007-4287(2015)11-1818-04

*通訊作者