王紅日等

摘要：以酵母EGY48為材料，研究了不同培養(yǎng)時(shí)間（12、16、20、24、30h）、細(xì)胞狀態(tài)（OD600）、電擊電壓（600、800、1000、1200、1400V）及不同質(zhì)粒DNA用量（1、2、5、10、15、20μg）對(duì)酵母電擊轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明：當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為20h、OD600=1.4、電擊電壓為1000V、質(zhì)粒用量為5μg時(shí)，該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率最高，為后續(xù)高效文庫(kù)的篩選奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：酵母；電擊轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化效率

中圖分類(lèi)號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）01-0029-03

酵母菌（Saccharomycescerevisiae）作為單細(xì)胞真核生物，是傳統(tǒng)食品工業(yè)的主要用菌，近年來(lái)更是低等真核生物基因工程表達(dá)的重要菌種。由于具有生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)和遺傳操作、具有比大腸桿菌更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物加工修飾及分泌的能力等優(yōu)點(diǎn)，酵母在基因工程的表達(dá)系統(tǒng)中日益受到重視。外源基因進(jìn)入酵母菌一般采用遺傳轉(zhuǎn)化的方法，1978年Himmen等[1]和Beggs[2]分別報(bào)道了酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，該方法轉(zhuǎn)化率較高，但需要脫去細(xì)胞壁進(jìn)行轉(zhuǎn)化后再生，步驟比較繁瑣，不利于轉(zhuǎn)化子的快速制備。隨后Ito等[3]建立了完整酵母轉(zhuǎn)化法，該方法簡(jiǎn)捷，但轉(zhuǎn)化率偏低。1985年，Karube等[4]和Hashimoto等[5]分別利用電擊法轉(zhuǎn)化酵母原生質(zhì)體及完整細(xì)胞獲得成功后，電擊轉(zhuǎn)化法以其高轉(zhuǎn)化率、操作方便等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到重視?，F(xiàn)在，電轉(zhuǎn)化技術(shù)不斷提高，已被廣泛用于酵母細(xì)胞外源基因?qū)胫衃5～11]。本試驗(yàn)以酵母EGY48為材料，研究了影響酵母電擊轉(zhuǎn)化的幾個(gè)因素，以期建立一套高效、簡(jiǎn)便的酵母外源基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為進(jìn)一步基因工程研究提供保障。

1材料與方法

1.1材料與試劑

酵母菌株：EGY48，為本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒：pLEXAD，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

YPD液體培養(yǎng)基：2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖；選擇培養(yǎng)基：SD/His-/Leu-培養(yǎng)基。各種培養(yǎng)用主要試劑和抗生素購(gòu)自Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司；其它化學(xué)藥品為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1感受態(tài)酵母的制備挑取直徑為2～3mm的酵母單菌落于內(nèi)有5mlYPD培養(yǎng)液的10ml搖管中，30℃、230～250r/min振蕩培養(yǎng)12～24h；取上述菌液0.5ml加入到內(nèi)有500mlYPD培養(yǎng)液的1L三角瓶中，30℃、230～250r/min分別振蕩培養(yǎng)12、16、20、24、30h，測(cè)其OD600值；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用500ml預(yù)冷的無(wú)菌水重懸；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用250ml預(yù)冷的無(wú)菌水重懸；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用20ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇重懸；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用1ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇溶解，使終體積約為1.5ml；每管分裝80μl，備用。

1.2.2酵母電擊轉(zhuǎn)化取不同體積一定濃度的質(zhì)粒DNA，使其終用量分別為1、2、5、10、15、20μg，分別加入80μl感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入0.2cm預(yù)冷的電擊杯中，冰上放置5min；采用伯樂(lè)電穿孔儀電擊，電壓分別設(shè)定600、800、1000、1200、1400V，電容25μF，電阻400Ω；后向電擊杯中立即加入1ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇，轉(zhuǎn)入1.5ml無(wú)菌離心管中；取200～600μl涂平板，30℃倒置培養(yǎng)3～6d，直至出現(xiàn)菌落。

2結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率的影響

將酵母分別培養(yǎng)12、16、20、24、30h后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，此時(shí)電壓采用1000V，質(zhì)粒DNA用量為2μg，其他條件均相同。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖1）表明：不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)平均轉(zhuǎn)化率的影響較大，培養(yǎng)20h、OD600值約為1.4的酵母轉(zhuǎn)化效果比較理想，平均轉(zhuǎn)化率最高，可達(dá)3.62×105轉(zhuǎn)化子/μgDNA。

不同生長(zhǎng)時(shí)期的酵母細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化率影響較大，本研究的結(jié)果顯示，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的酵母細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，該時(shí)期電擊轉(zhuǎn)化效果明顯高于穩(wěn)定期的細(xì)胞，推測(cè)可能是由于處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，更利于進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。對(duì)于感受態(tài)酵母的制備，建議現(xiàn)制現(xiàn)用，從而保證較高的轉(zhuǎn)化率。一般認(rèn)為，電擊轉(zhuǎn)化是通過(guò)觸發(fā)細(xì)胞膜使其電通透性增大，瞬間形成小孔，從而使各種生物大分子進(jìn)出細(xì)胞[14，15]。電壓較低時(shí)，細(xì)胞不容易瞬間形成微孔通道，質(zhì)粒DNA等生物大分子難以進(jìn)入細(xì)胞，無(wú)法完成轉(zhuǎn)化；電壓過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致大部分細(xì)胞因小孔形成較大，難以復(fù)原而死亡，降低了酵母細(xì)胞的存活率，也影響了轉(zhuǎn)化率。本試驗(yàn)條件下，電壓為1000V時(shí)，酵母轉(zhuǎn)化率最大。質(zhì)粒DNA的用量對(duì)電擊轉(zhuǎn)化率也有一定的影響，原因可能是當(dāng)質(zhì)粒DNA濃度較低時(shí)，電擊產(chǎn)生的細(xì)胞小孔可以允許大部分的DNA分子進(jìn)入細(xì)胞；但當(dāng)質(zhì)粒DNA用量增大，超過(guò)最大容納值時(shí)，細(xì)胞能吸收的DNA分子達(dá)到極限飽和狀態(tài)，反而降低了轉(zhuǎn)化率。

根據(jù)本試驗(yàn)方法，培養(yǎng)時(shí)間為20h、OD600=1.4、電擊電壓為1000V、質(zhì)粒用量為5μg時(shí)，該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率最為理想，可以滿足電擊轉(zhuǎn)化試驗(yàn)要求，為后續(xù)高效文庫(kù)的篩選奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]HinnenA，HicksJB，F(xiàn)inkJR.TransformationofYeast[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1978，75：1929-1933.

[2]BeggsJD.TransformationofYeastbyaReplicationHybridPlasmid[J].Nature，1978，275：104-109.endprint

[3]ItoH，F(xiàn)ukudaY，MurataK，etal.TransformationofIntactYeastCellsTreatedwithAlkaliCations[J].J.Bacteriol.，1983，153（1）：163-168.

[4]KarubeI，TamiyaE，MatsuokaH.TransformationofSaccharomycecerevisiaespheroplastsbyhighelectricpulse[J].FEBSLetts.，1985，182：90-94.

[5]HashimotoH，MorijawaH，YamataY，etal.AnovelmethodfortransformationofintactyeastcellsbyelectroinjectionofplasmidDNA[J].AppliedMicrobiol.Biotechnol.，1985；2：336-339.

[6]徐志武，張穎，王智學(xué)，等.一種高效的釀酒酵母和畢赤酵母電擊轉(zhuǎn)化法[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，49（3）：98-

101.

[7]高炳淼，唐天樂(lè)，長(zhǎng)孫東亭，等.畢赤酵母高效電轉(zhuǎn)化條件的研究[J].中國(guó)海洋藥物，2010，2：1-5.

[8]金筱耘，趙愛(ài)春，李軍，等.Monellin-EGFP融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)[J].食品科學(xué)，2012，33（13）：171-175.

[9]郭春和，焦茂興，何俊，等.抗菌肽CecropinD基因在畢赤酵母中的表達(dá)與抗菌活性分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33（11）：858-861.

[10]朱永梅，曹永生，李鑫，等.鵝干擾素-α的畢赤酵母表達(dá)及其生物學(xué)活性分析[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（4）：401-406.

[11]蘇嵐，曾令兵，周勇，等.草魚(yú)呼腸孤病毒VP6蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的初步研究[J].淡水漁業(yè)，2012，42（6）：38-42.

[12]奧斯伯F，金斯頓RE，塞德曼JG，等著.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M].顏?zhàn)臃f，王海林譯，金冬雁校.北京：科學(xué)出版社，1998，23-24.

[13]方勤，田靜.電轉(zhuǎn)化法提高平連載體DNA轉(zhuǎn)化效率的研究[J].生物技術(shù)，1999，9（4）：5-8.

[14]MeihocE，MassonJM，TeissieJ.Highefficiencytransformationofintactyeastcelllsbyelectricfieldpulses[J].Biotechnol.，1990，8（3）：223-227.

[15]秦玉靜，金建玲，鮑曉明，等.影響釀酒酵母電擊轉(zhuǎn)化率的條件[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，2：236-240.endprint

[3]ItoH，F(xiàn)ukudaY，MurataK，etal.TransformationofIntactYeastCellsTreatedwithAlkaliCations[J].J.Bacteriol.，1983，153（1）：163-168.

[4]KarubeI，TamiyaE，MatsuokaH.TransformationofSaccharomycecerevisiaespheroplastsbyhighelectricpulse[J].FEBSLetts.，1985，182：90-94.

[5]HashimotoH，MorijawaH，YamataY，etal.AnovelmethodfortransformationofintactyeastcellsbyelectroinjectionofplasmidDNA[J].AppliedMicrobiol.Biotechnol.，1985；2：336-339.

[6]徐志武，張穎，王智學(xué)，等.一種高效的釀酒酵母和畢赤酵母電擊轉(zhuǎn)化法[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，49（3）：98-

101.

[7]高炳淼，唐天樂(lè)，長(zhǎng)孫東亭，等.畢赤酵母高效電轉(zhuǎn)化條件的研究[J].中國(guó)海洋藥物，2010，2：1-5.

[8]金筱耘，趙愛(ài)春，李軍，等.Monellin-EGFP融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)[J].食品科學(xué)，2012，33（13）：171-175.

[9]郭春和，焦茂興，何俊，等.抗菌肽CecropinD基因在畢赤酵母中的表達(dá)與抗菌活性分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33（11）：858-861.

[10]朱永梅，曹永生，李鑫，等.鵝干擾素-α的畢赤酵母表達(dá)及其生物學(xué)活性分析[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（4）：401-406.

[11]蘇嵐，曾令兵，周勇，等.草魚(yú)呼腸孤病毒VP6蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的初步研究[J].淡水漁業(yè)，2012，42（6）：38-42.

[12]奧斯伯F，金斯頓RE，塞德曼JG，等著.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M].顏?zhàn)臃f，王海林譯，金冬雁校.北京：科學(xué)出版社，1998，23-24.

[13]方勤，田靜.電轉(zhuǎn)化法提高平連載體DNA轉(zhuǎn)化效率的研究[J].生物技術(shù)，1999，9（4）：5-8.

[14]MeihocE，MassonJM，TeissieJ.Highefficiencytransformationofintactyeastcelllsbyelectricfieldpulses[J].Biotechnol.，1990，8（3）：223-227.

[15]秦玉靜，金建玲，鮑曉明，等.影響釀酒酵母電擊轉(zhuǎn)化率的條件[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，2：236-240.endprint

[3]ItoH，F(xiàn)ukudaY，MurataK，etal.TransformationofIntactYeastCellsTreatedwithAlkaliCations[J].J.Bacteriol.，1983，153（1）：163-168.

[4]KarubeI，TamiyaE，MatsuokaH.TransformationofSaccharomycecerevisiaespheroplastsbyhighelectricpulse[J].FEBSLetts.，1985，182：90-94.

[5]HashimotoH，MorijawaH，YamataY，etal.AnovelmethodfortransformationofintactyeastcellsbyelectroinjectionofplasmidDNA[J].AppliedMicrobiol.Biotechnol.，1985；2：336-339.

[6]徐志武，張穎，王智學(xué)，等.一種高效的釀酒酵母和畢赤酵母電擊轉(zhuǎn)化法[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，49（3）：98-

101.

[7]高炳淼，唐天樂(lè)，長(zhǎng)孫東亭，等.畢赤酵母高效電轉(zhuǎn)化條件的研究[J].中國(guó)海洋藥物，2010，2：1-5.

[8]金筱耘，趙愛(ài)春，李軍，等.Monellin-EGFP融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)[J].食品科學(xué)，2012，33（13）：171-175.

[9]郭春和，焦茂興，何俊，等.抗菌肽CecropinD基因在畢赤酵母中的表達(dá)與抗菌活性分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33（11）：858-861.

[10]朱永梅，曹永生，李鑫，等.鵝干擾素-α的畢赤酵母表達(dá)及其生物學(xué)活性分析[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（4）：401-406.

[11]蘇嵐，曾令兵，周勇，等.草魚(yú)呼腸孤病毒VP6蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的初步研究[J].淡水漁業(yè)，2012，42（6）：38-42.

[12]奧斯伯F，金斯頓RE，塞德曼JG，等著.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M].顏?zhàn)臃f，王海林譯，金冬雁校.北京：科學(xué)出版社，1998，23-24.

[13]方勤，田靜.電轉(zhuǎn)化法提高平連載體DNA轉(zhuǎn)化效率的研究[J].生物技術(shù)，1999，9（4）：5-8.

[14]MeihocE，MassonJM，TeissieJ.Highefficiencytransformationofintactyeastcelllsbyelectricfieldpulses[J].Biotechnol.，1990，8（3）：223-227.

[15]秦玉靜，金建玲，鮑曉明，等.影響釀酒酵母電擊轉(zhuǎn)化率的條件[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，2：236-240.endprint