王振寶等

摘要：細胞質雄性不育（CMS）在作物遺傳育種研究中占有重要地位，多種植物的細胞質雄性不育均與線粒體基因結構變異及新嵌合基因的產生有關。為探索線粒體atp6基因與洋蔥CMS的關系，以13份不育系和11份保持系為材料克隆洋蔥atp6基因編碼序列，測序結果表明不同材料atp6基因間存在一個C/A多態(tài)性位點，該多態(tài)性位點在不育系和保持系間隨機出現，而不是不育系與保持系的特征差異。蛋白質分析表明這一多態(tài)性位點的變異并未改變atp6蛋白跨膜結構。進一步的蛋白比對分析揭示了atp6蛋白在物種間有一定的保守性，特別是第IV跨膜結構域的Arg在所有物種中是高度保守的，也是H+轉運所必需的。基于atp6蛋白序列的系統(tǒng)進化樹顯示細菌和病毒位于樹的基部，其次是真菌、低等藻類以及原生生物，然后高等藻類、苔蘚和蕨類，高等綠色開花植物處于樹的頂端，單子葉植物處于樹的最頂端。

關鍵詞：洋蔥；雄性不育；atp6基因；系統(tǒng)進化

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）01-0010-05

洋蔥（AlliumcepaL.）又名玉蔥、圓蔥、蔥頭等，起源于亞洲西部，屬于百合科蔥蒜屬二年生蔬菜，廣泛種植于世界各地。洋蔥于近代傳入我國，由于具有適應性強、耐貯藏和運輸的特點，發(fā)展迅速。洋蔥是類黃酮的重要食物來源之一，對人體的健康有很大的影響，它具有廣泛的生物活性和重要的藥用價值，在防止心血管疾病、抗腫瘤、抗自由基、抗氧化、抗過敏、消炎、抗病毒等方面有重要作用[1]。

洋蔥是最早利用雄性不育系育種的蔬菜作物之一，雄性不育的產生通常是由于線粒體基因的插入、缺失、重排等造成的基因突變以及形成新的嵌合基因[2]。在以往的研究中，此類基因主要為能量代謝相關蛋白（ATP、Cob、Cox和NAD/NADP）基因[3]。atp6基因是重要的線粒體功能基因，編碼F1F0-ATP合成酶系統(tǒng)中F0部分最大亞基——A亞基[4]。目前已知水稻、油菜、蘿卜、大豆的雄性不育與atp6基因的突變有關[5～8]。前人的研究表明，在S（Sterile）型細胞質與N/T（Normal）型細胞質之間，atp6基因的編碼序列存在一個堿基的突變[9，10]，該突變是否是導致雄性不育的原因目前尚無定論。本研究克隆了洋蔥13個不育系與11個保持系的atp6基因，對其核酸和編碼蛋白序列進行了生物信息學及進化樹分析，以期通過單倍型的分布和蛋白質結構分析，探究atp6基因是否是導致洋蔥雄性不育的直接原因。

1材料與方法

1.1試驗材料

以13份雄性不育系（110，118，502，503，101，117-5，117-11-1，117-10-1，117-10-2，117-10-3，L701，L702和L703）和11份保持系（210，218，602，603，202，217-5，217-11-1，217-10-1，217-10-2，217-10-3和L801）為材料進行基因克隆[11]。洋蔥新鮮葉片采自山東省農業(yè)科學院蔬菜研究所試驗基地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，于-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2洋蔥基因組總DNA的提取

洋蔥基因組總DNA的提取采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，北京），方法參照操作說明書。

1.3洋蔥atp6基因克隆

本研究所用的上游引物P1：5′-ATGAGTGCTGAAAGTAGGAAAGAGTA-3′，下游引物P2：5′-TCAATGTTGATATGACTCATTTTGATG-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

PCR反應總體積為25μl，其中模板（基因組DNA）1μl，2.5mmol/LdNTPs4μl，10×LATaqbuffer2.5μl，引物各1μl，TaKaRaLATaq0.25μl，用滅菌蒸餾水補齊至25μl。擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃保溫10min，4℃保存。

PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍照記錄。目的條帶用凝膠回收試劑盒（Tiangen，北京）回收，與克隆載體pMD18-T（寶生物，大連）連接，轉化大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α感受態(tài)細胞，經藍白斑篩選、菌液PCR鑒定后，將陽性克隆送博尚生物技術有限公司進行測序。

1.4序列分析

利用DNAMAN和Blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）進行序列比對；SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）、TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）用于蛋白質的二級結構分析；MEGA5用于系統(tǒng)進化樹分析。

2結果與分析

2.1洋蔥atp6基因的克隆與序列特征

PCR擴增產物電泳結果（圖1）顯示，擴增片段大小約為800bp，與預期片段大小相吻合。將陽性克隆進行序列測定及分析后發(fā)現，24個洋蔥育種系的atp6基因間存在一個多態(tài)性位點C/A，且該多態(tài)性位點在不育系內、保持系內以及不育系和保持系間均隨機出現（表1）。這一結果表明，C/A多態(tài)性位點的突變并不是不育系或者保持系所特有的共性突變。

洋蔥atp6基因編碼蛋白序列與已報道其他物種同源序列相似度從40%到90%不等，相似度最高的物種為海棗（Phoenixdactylifera），最低的為印度洋大洋桿菌（Oceanibaculumindicum）。其中第IV跨膜結構域的Arg在所有物種中是高度保守的，也是H+轉運所必需的。

為進一步了解atp6蛋白的進化、分類以及作為系統(tǒng)進化研究材料的可能性，對101條來自不同物種的atp6蛋白序列進行序列聯配，并用ML法構建系統(tǒng)進化樹，進化樹直觀地顯示了高等綠色植物、藻類、真菌、細菌和病毒之間的親緣關系（圖3）。細菌和病毒位于樹的基部，其次是真菌、原生生物以及綠藻，然后是高等植物。在高等綠色開花植物分支內部，所有的雙子葉植物均處于一個大的分支上，單子葉植物存在多個分支，且單子葉植物處于樹的最頂端。

3結論與討論

本試驗以13份雄性不育系和11份保持系為材料克隆了洋蔥atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋蔥atp6基因在92bp處存在一個多態(tài)性位點C/A，這個多態(tài)性位點在不育系內、保持系內以及不育系和保持系之間隨機出現。該多態(tài)性位點堿基的突變（C-A）使得第31位Ser突變?yōu)門yr，然而第一跨膜結構域起始位點為第34位，并未引起atp6跨膜結構域的變化，說明洋蔥atp6基因在該多態(tài)性位點的變異，并不是造成洋蔥細胞質雄性不育的直接原因。

系統(tǒng)進化樹分析表明，atp6基因編碼蛋白在整體上是根據物種類型聚類的，可以明顯的劃分為四類，細菌和病毒，真菌、低等藻類和原生生物，高等藻類、苔蘚和蕨類，及高等綠色開花植物。細菌和病毒位于樹的基部，說明其在進化地位上是最原始的類型，其次是真菌、原生生物以及低等藻類，然后是高等藻類、苔蘚和蕨類，高等植物處于樹的頂端，且單子葉植物處于樹的最頂端，這個結果符合生物起源與進化的關系[12]。系統(tǒng)進化樹的分析結果也支持高等綠色植物和現代藻類均與Mesostigmaviride（原始綠藻）具有共同祖先的觀點[13]。在高等綠色開花植物分支內部，單子葉植物的洋蔥、海棗和雙子葉植物處于一個分支，單子葉植物內部也存在多個不同起源，這說明在單、雙子葉植物分化以前atp6基因已經產生了分化，或者是單、雙子葉植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能夠反映物種進化的先后順序，但atp6基因的進化與物種的進化并不是完全同時發(fā)生的。

參考文獻：

[1]霍鳳梅，繆軍，吳雄，等.洋蔥查爾酮合成酶基因的分子克隆和表達分析[J].山東農業(yè)科學，2010，5：1-4.

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[3]HansonMR，BentolilaS.Interactionsofmitochondrialandnucleargenesthataffectmalegametophytedevelopment[J].ThePlantCell，2004，16（S）：154-169.

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[6]MakaroffCA，ApelIJ，PalmerJD.Theatp6codingregionhasbeendisruptedandnovelreadingframegeneratedinthemitochondrialgenomeofcytoplasmicmale-sterileradish[J].JournalofBiologicalChemistry，1989，264（20）：11706-11713.

[7]LandgrenM，ZetterstrandM，SundbergE，etal.Alloplasmicmale-sterileBrassicalinescontainingB.tournefortiimitochondriaexpressanORF3′oftheatp6geneanda32kDaprotein[J].PlantMol.Biol.，1996，32（5）：879-890.

[8]韓利濤，楊守萍，喻德躍，等.大豆細胞質雄性不育系與保持系atp6基因的RNA編輯比較研究[J].大豆科學，2010，29（3）：361-365.

[9]趙婷，朱騰義.煙草線粒體基因atp6的SNP及其與CMS的相關性[J].作物學報，2009，35（9）：1655-1661.

[10]周曉娟，趙瑞，王永勤.洋蔥異源胞質雄性不育候選基因atp6的克隆與表達分析[J].沈陽農業(yè)大學學報，2012，43（2）：148-152.

[11]YangYY，HuoYM，WangZB，etal.IdentificationoftwoSCARmarkersco-segregatedwiththedominantMsandrecessivemsallelesinonion（AlliumcepaL.）[J].Euphytica，2013，190（2）：267-277.

[12]CronquistA.Anintegratedsystemofclassificationoffloweringplants[M].NewYork：ColumbiaUniv.Press，1981.

[13]BhattacharyaD，WeberK，AnSS，etal.ActinphylogenyidentifiesMesostigmavirideasaflagellateancestorofthelandplants[J].MolecularBiologyandEvolution，1998，47（5）：544-553.

為進一步了解atp6蛋白的進化、分類以及作為系統(tǒng)進化研究材料的可能性，對101條來自不同物種的atp6蛋白序列進行序列聯配，并用ML法構建系統(tǒng)進化樹，進化樹直觀地顯示了高等綠色植物、藻類、真菌、細菌和病毒之間的親緣關系（圖3）。細菌和病毒位于樹的基部，其次是真菌、原生生物以及綠藻，然后是高等植物。在高等綠色開花植物分支內部，所有的雙子葉植物均處于一個大的分支上，單子葉植物存在多個分支，且單子葉植物處于樹的最頂端。

3結論與討論

本試驗以13份雄性不育系和11份保持系為材料克隆了洋蔥atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋蔥atp6基因在92bp處存在一個多態(tài)性位點C/A，這個多態(tài)性位點在不育系內、保持系內以及不育系和保持系之間隨機出現。該多態(tài)性位點堿基的突變（C-A）使得第31位Ser突變?yōu)門yr，然而第一跨膜結構域起始位點為第34位，并未引起atp6跨膜結構域的變化，說明洋蔥atp6基因在該多態(tài)性位點的變異，并不是造成洋蔥細胞質雄性不育的直接原因。

系統(tǒng)進化樹分析表明，atp6基因編碼蛋白在整體上是根據物種類型聚類的，可以明顯的劃分為四類，細菌和病毒，真菌、低等藻類和原生生物，高等藻類、苔蘚和蕨類，及高等綠色開花植物。細菌和病毒位于樹的基部，說明其在進化地位上是最原始的類型，其次是真菌、原生生物以及低等藻類，然后是高等藻類、苔蘚和蕨類，高等植物處于樹的頂端，且單子葉植物處于樹的最頂端，這個結果符合生物起源與進化的關系[12]。系統(tǒng)進化樹的分析結果也支持高等綠色植物和現代藻類均與Mesostigmaviride（原始綠藻）具有共同祖先的觀點[13]。在高等綠色開花植物分支內部，單子葉植物的洋蔥、海棗和雙子葉植物處于一個分支，單子葉植物內部也存在多個不同起源，這說明在單、雙子葉植物分化以前atp6基因已經產生了分化，或者是單、雙子葉植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能夠反映物種進化的先后順序，但atp6基因的進化與物種的進化并不是完全同時發(fā)生的。

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為進一步了解atp6蛋白的進化、分類以及作為系統(tǒng)進化研究材料的可能性，對101條來自不同物種的atp6蛋白序列進行序列聯配，并用ML法構建系統(tǒng)進化樹，進化樹直觀地顯示了高等綠色植物、藻類、真菌、細菌和病毒之間的親緣關系（圖3）。細菌和病毒位于樹的基部，其次是真菌、原生生物以及綠藻，然后是高等植物。在高等綠色開花植物分支內部，所有的雙子葉植物均處于一個大的分支上，單子葉植物存在多個分支，且單子葉植物處于樹的最頂端。

3結論與討論

本試驗以13份雄性不育系和11份保持系為材料克隆了洋蔥atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋蔥atp6基因在92bp處存在一個多態(tài)性位點C/A，這個多態(tài)性位點在不育系內、保持系內以及不育系和保持系之間隨機出現。該多態(tài)性位點堿基的突變（C-A）使得第31位Ser突變?yōu)門yr，然而第一跨膜結構域起始位點為第34位，并未引起atp6跨膜結構域的變化，說明洋蔥atp6基因在該多態(tài)性位點的變異，并不是造成洋蔥細胞質雄性不育的直接原因。

系統(tǒng)進化樹分析表明，atp6基因編碼蛋白在整體上是根據物種類型聚類的，可以明顯的劃分為四類，細菌和病毒，真菌、低等藻類和原生生物，高等藻類、苔蘚和蕨類，及高等綠色開花植物。細菌和病毒位于樹的基部，說明其在進化地位上是最原始的類型，其次是真菌、原生生物以及低等藻類，然后是高等藻類、苔蘚和蕨類，高等植物處于樹的頂端，且單子葉植物處于樹的最頂端，這個結果符合生物起源與進化的關系[12]。系統(tǒng)進化樹的分析結果也支持高等綠色植物和現代藻類均與Mesostigmaviride（原始綠藻）具有共同祖先的觀點[13]。在高等綠色開花植物分支內部，單子葉植物的洋蔥、海棗和雙子葉植物處于一個分支，單子葉植物內部也存在多個不同起源，這說明在單、雙子葉植物分化以前atp6基因已經產生了分化，或者是單、雙子葉植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能夠反映物種進化的先后順序，但atp6基因的進化與物種的進化并不是完全同時發(fā)生的。

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[7]LandgrenM，ZetterstrandM，SundbergE，etal.Alloplasmicmale-sterileBrassicalinescontainingB.tournefortiimitochondriaexpressanORF3′oftheatp6geneanda32kDaprotein[J].PlantMol.Biol.，1996，32（5）：879-890.

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[9]趙婷，朱騰義.煙草線粒體基因atp6的SNP及其與CMS的相關性[J].作物學報，2009，35（9）：1655-1661.

[10]周曉娟，趙瑞，王永勤.洋蔥異源胞質雄性不育候選基因atp6的克隆與表達分析[J].沈陽農業(yè)大學學報，2012，43（2）：148-152.

[11]YangYY，HuoYM，WangZB，etal.IdentificationoftwoSCARmarkersco-segregatedwiththedominantMsandrecessivemsallelesinonion（AlliumcepaL.）[J].Euphytica，2013，190（2）：267-277.

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