盛美意　周心艷　方　萍　李秀東

(1.紹興文理學(xué)院　化學(xué)化工學(xué)院　浙江　紹興312000；2.紹興文理學(xué)院　元培學(xué)院　浙江　紹興312000)

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HPLC-DAD快速測定飲品中咖啡因含量

盛美意1周心艷2方萍1李秀東1

(1.紹興文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院浙江紹興312000；2.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院浙江紹興312000)

摘要：建立了一種快速測定飲品中咖啡因的高效液相色譜-二極管陣列檢測法(HPLC-DAD法).流動相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液(20∶10∶70)，檢測波長273 nm，流速1.0 mL/min.結(jié)果表明，在咖啡因濃度為0.003~0.120 mg/mL范圍內(nèi)，線性良好(R2=0.9999)；方法精密度RSD為1.75%；重復(fù)性RSD為0.51%；平均加標(biāo)回收率為99%~103%.

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-二極管陣列檢測法；咖啡因；飲品

0引言

咖啡因是日常飲料中的主要成分，如1g雀巢咖啡約含咖啡因35 mg，1g茶約含咖啡因20～35 mg，1 000 mL可樂飲料含咖啡因90～100 mg[1].在北美，一個成年人平均每天攝入咖啡因約200～250 mg，我國咖啡因的消耗量也在逐年增加[2].咖啡因是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮藥，不僅對心血管系統(tǒng)具有正性作用，還能促進(jìn)胃酸分泌和治療偏頭痛等疾病.適度地使用咖啡因有祛除疲勞、興奮神經(jīng)的作用，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱和昏迷復(fù)蘇.但大劑量或長期使用也會對人體造成損害，特別是它具有成癮性，一旦停用會出現(xiàn)精神萎靡不振、渾身困乏等各種戒斷癥狀，因此被列入受國家管制的精神藥品范圍[3].

可樂型飲料、咖啡、茶葉及制成品中咖啡因含量的測定方法有許多，有薄層色譜法[4]、紫外光譜分析法[5-6]、色-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS法)、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)等.其中高效液相色譜法[7-13](HPLC)是最為普遍和實(shí)用的.本實(shí)驗(yàn)主要以綠茶為代表性樣品，用正交試驗(yàn)對其中咖啡因的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時對HPLC條件進(jìn)行了優(yōu)化，并用優(yōu)化好的方法對不同種類飲品中的咖啡因進(jìn)行了測定.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器和材料

實(shí)驗(yàn)儀器：Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司，配二極管陣列檢測器)；SK3210HP超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；UPWS超純水器(杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司).

實(shí)驗(yàn)材料：咖啡因(GBW(E)130142)為高純度(天津市計量監(jiān)督檢測科學(xué)研究院)；甲醇、乙腈為色譜純(美國天地試劑有限公司)；無水甲酸、三氯甲烷均為分析純(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，取自ΜPWS超純水器；7種不同種類飲品均購自超市.

1.2　咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品配制

別為0.003、0.006、0.012、0.030、0.060、0.120、10.000 mg/mL的咖啡因?qū)φ掌啡芤?

1.3　樣品制備

液體樣品：取脫氣后試樣10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，取1mL續(xù)濾液備用.

茶及咖啡類等固體樣品：精密稱取粉碎均勻的樣品100.0 mg，加水適量，定容至100.0 mL，搖勻，超聲提取60 min，進(jìn)行脫氣至無氣泡產(chǎn)生.取10 mL過0.45 μm微孔濾膜，取1 mL續(xù)濾液備用.

1.4　HPLC的條件

色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6×150 mm，5 μm)，流動相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸=20∶10∶70，進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長273 nm.

2結(jié)果與討論

2.1　色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動相的選擇

在保持其他色譜條件相同的情況下，分別在流動相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸=20∶10∶70[9]，甲醇-乙腈-水=57∶29∶14(每升流動相中加入0.8 mol/L乙酸液50 mL)[11]，甲醇-水=23∶77[13]下觀察咖啡因的出峰效果和峰形，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.圖1表明，流動相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸=20∶10∶70時峰形最好，分離效果最佳.

圖1　咖啡因在不同流動相中的高效液相色譜圖

2.1.2檢測波長的選擇

用二極管陣列檢測器在線掃描咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.圖2表明，咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液最大吸收波長分別是210 nm和273 nm，因在210 nm處測樣品時有雜質(zhì)干擾，故選定273 nm為檢測波長.

圖2　咖啡因紫外吸收圖

2.2　咖啡因前處理方法的選擇

對綠茶中咖啡因的提取方法、提取溶劑、提取時間等因素進(jìn)行(2×3×3)正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.由表1可見，提取方法為超聲、提取溶劑為超純水、提取時間為60 min的方法最佳，峰面積最大，故選取這一方法為樣品中咖啡因的提取方法.

今寧波設(shè)立的“平字水則”建立在宋寶祐年間（1253—1258年）的古“平字水則”基礎(chǔ)上。據(jù)史書記載，在溫州譙樓前五福橋上的“永嘉水則”為宋元祐三年（1088年）所立，比寧波“平字水則”早170年，并具有管理運(yùn)用功能，是至今為止發(fā)現(xiàn)最早的 “平字水則”。出土于溫州的“開平閘”石刻，顯然與“平字水則”有著必然的聯(lián)系，“平字水則”的“平”字極有可能取自“開平閘”的簡化運(yùn)用。因此，“開平閘”石刻很可能是“平字水則”的前身，“平字水則”是其演化的結(jié)果。它既是石刻記錄，又具運(yùn)用調(diào)度功能，是“水則”發(fā)展史中第二階段到第三階段的過渡。

表12×3×3正交試驗(yàn)

序號方法溶劑時間/min峰面積1超聲超純水201340.42超聲超純水401529.93超聲超純水601571.74超聲甲醇201273.35超聲甲醇401495.76超聲甲醇601501.77超聲三氯甲烷2096.28超聲三氯甲烷40115.59超聲三氯甲烷60122.410浸泡超純水201220.311浸泡超純水401368.412浸泡超純水601456.913浸泡甲醇201166.814浸泡甲醇401349.615浸泡甲醇601397.216浸泡三氯甲烷2087.817浸泡三氯甲烷40102.918浸泡三氯甲烷60116.7

2.3　線性范圍、精密度、重現(xiàn)性及回收率

將配置好的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液按以上色譜條件測定，以峰面積對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得在0.003～0.120 mg/mL濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程為：

Y=56136x+29.303，

其相關(guān)系數(shù)R2=0.9999.此方法既好又寬的線性范圍可以滿足不同種類飲品咖啡因含量的測定.

精密吸取0.03 mg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，重復(fù)6次進(jìn)樣，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.75%，小于2%，說明儀器精密度良好.

取同一批綠茶樣品6份，每份精密稱取100.0 mg，按以上方法制備樣品并測定，得到綠茶中咖啡因平均含量是27.51 mg/g，RSD為0.51%，說明該方法的重現(xiàn)性好.

在綠茶樣品中分別加入咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg、2.00 mg、5.00 mg，按以上方法制備樣品并上機(jī)測試，根據(jù)在實(shí)際樣品中提取出的咖啡因含量和標(biāo)準(zhǔn)品含量之比計算回收率，得平均回收率為99.16%～103.38%，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.表2結(jié)果說明，該提取方法切實(shí)可行，具有很好的準(zhǔn)確度.

2.4　實(shí)際樣品的測定

分別取康師傅綠茶、康師傅冰紅茶、百事可樂、綠茶、大肚子茶、摩卡特濃奶茶、摩卡咖啡等飲品，按以上方法制備樣品并上機(jī)測試，結(jié)果見表3.

表2綠茶中咖啡因的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

樣 品本底值/(mg·g-1)加標(biāo)量/mg平均測定值/(mg·g-1)回收率/%綠茶1綠茶2綠茶327.711.0037.6299.162.0047.86100.755.0079.40103.38

表3不同飲品的咖啡因含量的測定結(jié)果

名 稱含 量(mg/mL或mg/g)康師傅綠茶10.13康師傅綠茶20.14康師傅冰紅茶10.07康師傅冰紅茶20.07百事可樂10.11百事可樂20.11綠茶128.16綠茶227.94大肚子茶110.63大肚子茶210.56摩卡特濃奶茶11.51摩卡特濃奶茶21.48摩卡咖啡134.15摩卡咖啡234.20

3結(jié)論

本文利用高效液相色譜-二極管陣列檢測法快速測定了飲品中咖啡因的含量，探討了咖啡因的提取方法并優(yōu)化了色譜條件.該方法的提取溶劑為超純水，對環(huán)境友好，分析速度快，儀器測試時間在10 min內(nèi)完成，極大地節(jié)約了測試成本，提高了工作效率.同時對不同飲品中的咖啡因進(jìn)行了測定分析.該方法線性范圍寬，具有良好的重現(xiàn)性和回收率，可用于不同種類飲品中咖啡因含量的測定.

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(責(zé)任編輯鄧穎)

Rapid Determination of Caffeine in Beverages by HPLC-DAD

Sheng Meiyi1Zhou Xinyan2Fang Ping1Li Xiudong1

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000;

2. College of Yuanpei, Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000)

Abstract：An analytical method for rapid determination of caffeine in beverages was established by high performance liquid chromatography-diode array detection. The chromatography conditions were optimized as follows: Mobile phase consisted of methanol-acetonitrile- 0.1% formic acid (20∶10∶70), the detection wavelength was set at 273 nm, and the flow rate was 1.0 mL/min. The results showed that there was a good linearity within the range of 0.003~0.12 mg/mL(R2=0.9999). The Precision RSD was 1.75%. The repeatability RSD was 0.51%. The average recovery was 99%~103%. This simple, rapid, accurate and reproducible method can be used as an analysis method for determining caffeine in beverages.

Key words：HPLC-DAD; caffeine; beverage

中圖分類號：O657.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-293X(2015)10-0021-03

doi：10.16169/j.issn.1008-293x.k.2015.10.05

*收稿日期：2015-06-08基金項(xiàng)目：紹興文理學(xué)院校級科研項(xiàng)目(2014LG1003)

作者簡介：盛美意(1987-)，女，浙江新昌人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：色質(zhì)譜分析.