王起明　孫燁超　厲申捷　葉建平

(紹興文理學(xué)院　生命科學(xué)學(xué)院，浙江　紹興312000)

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白眉長(zhǎng)臂猿基因組BAC文庫(kù)的構(gòu)建

王起明孫燁超厲申捷葉建平*

(紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江紹興312000)

摘要：通過(guò)溫和的物理方法獲得白眉長(zhǎng)臂猿高質(zhì)量的基因組DNA，EcoRⅠ和EcoRⅠ甲基化酶部分酶切后經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆的保存，構(gòu)建了含有85 800個(gè)克隆的全基因組BAC(Bacterial artificial chromosome)文庫(kù).隨機(jī)選取250個(gè)BAC克隆進(jìn)行NotI酶切及脈沖場(chǎng)電泳分析，結(jié)果表明該文庫(kù)的平均插入片段大小為110 kb，非重組克隆(無(wú)插入片段)的比率為10.0%.假定白眉長(zhǎng)臂猿的基因組大小為3×106kb，根據(jù)文庫(kù)的平均插入片段大小，則該文庫(kù)具有3倍的基因組覆蓋率.

關(guān)鍵詞：白眉長(zhǎng)臂猿；基因組文庫(kù)；BAC文庫(kù)

白眉長(zhǎng)臂猿(Hylobateshoolock)隸屬于靈長(zhǎng)目(Primates)長(zhǎng)臂猿科(Hylobatidae)，為東洋界緬甸-中國(guó)亞區(qū)的特有種.白眉長(zhǎng)臂猿在國(guó)外主要分布于緬甸的北部以及印度東北部的阿薩姆；國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)于云南西部怒江以西的騰沖、盈江、保山等地[1-2].由于其種群數(shù)量日漸稀少，分布范圍狹窄，現(xiàn)已經(jīng)被列為中國(guó)國(guó)家I級(jí)保護(hù)種類[3].目前國(guó)內(nèi)對(duì)白眉長(zhǎng)臂猿的研究主要集中在種群數(shù)量、分布現(xiàn)狀以及食物的選擇等方面的調(diào)查[4-6].如，張興勇等[4]曾采用走訪和現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查的方式，對(duì)保山市隆陽(yáng)區(qū)百花林和赧亢以及騰沖縣大塘的白眉長(zhǎng)臂猿的數(shù)量進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明調(diào)查區(qū)內(nèi)約有白眉長(zhǎng)臂猿15～20群，數(shù)量25～40只.但目前對(duì)白眉長(zhǎng)臂猿基因組結(jié)構(gòu)等基礎(chǔ)研究卻鮮有涉及[7]，究其根源是沒(méi)有一個(gè)良好的基因組研究平臺(tái)，能對(duì)白眉長(zhǎng)臂猿基因組研究提供有力的支持.

基因組文庫(kù)是指，由DNA體外重組技術(shù)把基因組片段和載體相連并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而獲得的某一特定生物全基因組的克隆集合.集合中的每個(gè)克隆包含有一段特定的基因組DNA.由于體外重組使用的載體與用于保存基因組DNA片段的生物宿主系統(tǒng)不同，因而基因組文庫(kù)有許多類型.與其它基因組文庫(kù)相比，細(xì)菌人工染色體文庫(kù)(BAC Library)具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)大腸桿菌F質(zhì)粒中的F因子使得BAC克隆以單拷貝的形式存在于重組酶Rec-缺陷型的大腸桿菌宿主中，這使得BAC DNA在細(xì)菌中十分穩(wěn)定，與YAC文庫(kù)相比，很少有嵌合體存在；(2)由于BAC DNA是以超螺旋的形式存在于宿主菌中，因此通過(guò)普通的堿裂解法可以方便地提取到完整的BAC DNA；(3)BAC載體可容納的插入片段較大，最高可達(dá)300 kb，片段中包含足夠多的基因組信息，適用于許多研究領(lǐng)域.這些優(yōu)點(diǎn)都使其在動(dòng)植物基因組研究中得到廣泛的應(yīng)用[8-9].

構(gòu)建白眉長(zhǎng)臂猿基因組BAC文庫(kù)不僅有利于永久保存和有效利用其基因資源，同時(shí)也可為全基因組測(cè)序的順利完成奠定基礎(chǔ)，并為比較基因組研究提供重要資源.

1材料與方法

1.1　材料

實(shí)驗(yàn)用白眉長(zhǎng)臂猿材料來(lái)源于EBV轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞；構(gòu)建BAC文庫(kù)則采用美國(guó)Epicentre公司的CCBAC1E BAC文庫(kù)構(gòu)建試劑盒.

1.2　方法

1.2.1高分子量基因組DNA的制備

將白眉長(zhǎng)臂猿細(xì)胞液置于50℃水浴中預(yù)熱5 min，加入等體積、冷卻至50℃的1%低熔點(diǎn)瓊脂糖，充分混勻后快速分裝至預(yù)先用紫外線照射且置于冰上的栓塊模具中，每個(gè)小槽約80 μL，冰上凝固約1 h，形成瓊脂糖凝栓塊(Plug).取出凝固好的栓塊，置于50℃的L緩沖液(含100 mM EDTA，10 mM Tris-Cl，20 mM NaCl，1%十二烷基肌酸鈉，0.2 mg/mL的蛋白酶k，pH 8.0)中消化，直至得到質(zhì)地均勻、完全透明的栓塊，栓塊有瓊脂糖包裹著的高分子量基因組DNA.裂解后的栓塊放入50倍體積冰冷的1×TE(pH 7.6)中，并置于4℃冰箱的搖床上重復(fù)洗栓塊3次，每次30 min.將栓塊轉(zhuǎn)到含有40 μg/mL苯甲基磺酰氟的1×TE中，50℃水浴30 min后，即可將栓塊轉(zhuǎn)到20%的NDS(2 mM Tris，6.8 mM N-laruoylsarcosine，127 mM EDTA，pH 9.0)中，于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.2.2EcoR I酶切條件的確定

由于不同物種的基因組DNA對(duì)于EcoR I的敏感程度不一樣，為獲得合適的酶切條件，需要對(duì)EcoR I和EcoR I甲基化酶的相對(duì)用量進(jìn)行酶切反應(yīng)的條件優(yōu)化.取3塊栓塊切成6小塊后，分別放入含有420 μLEcoR I 緩沖液，1.25 μl SAM，5 μL 100×BSA，1 UEcoR I(使用前用EcoR I緩沖液稀釋成0.1 U/μL，取10 μL)和梯度的EcoR I甲基化酶(0，5，10，25，50，100 U)的2 mL離心管中，冰浴30 min使酶滲透到栓塊內(nèi)部與DNA充分接觸，然后將離心管置于37℃水浴酶切2 h.消化后的栓塊轉(zhuǎn)入20 % NDS以終止反應(yīng).脈沖場(chǎng)電泳以溫度14℃、6 V/cm、角度120°、脈沖時(shí)間0.1～40 s 、14 h的條件檢測(cè)酶切結(jié)果，以確定EcoR I甲基化酶的最適用量.

1.2.3部分酶切和大片段DNA的二次回收

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)確定的EcoR I和EcoR I甲基化酶的最適用量，進(jìn)行大量酶切栓塊DNA，并進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳.電泳后切下兩邊的marker和一小部分的DNA，并用溴化乙錠染色以確定100～200 kb DNA片斷的范圍.從未染色的凝膠塊中間部分切割分子量大小在100～200 kb之間膠塊，并將其按照大小100～150 kb，150～200 kb分成兩份后，重新嵌入到新配制的膠中進(jìn)行第二次脈沖場(chǎng)電泳，以去除纏裹在大片段內(nèi)部的小片段DNA.電泳后切割分子量約100～200 kb之間的膠塊放于透析袋中，電泳透析回收DNA 大片段.

1.2.4BAC文庫(kù)的構(gòu)建

將經(jīng)EcoR I酶切、回收獲得的大片段DNA與載體按照CopyControl BAC Cloning Kit說(shuō)明15℃連接過(guò)夜.將連接產(chǎn)物置于0.5×TE (pH 8.0)的微孔過(guò)濾膜(0.025 μm，Millipore)上，透析2 h，以除去連接反應(yīng)中的鹽.用廣口槍頭取2 μL 除鹽后的連接產(chǎn)物與20 μL感受態(tài)細(xì)胞混勻，進(jìn)行電激轉(zhuǎn)化(條件為：電壓1.5 kV，電容 25 μF，電阻100).電擊后的所有產(chǎn)物加入到1 mL SOC培養(yǎng)基中，于 溫度37℃、轉(zhuǎn)速200～250 r/min的搖床上培養(yǎng)1 h后，取100 μL培養(yǎng)物涂在LB 固體培養(yǎng)基上(含有12.5 μg/mL氯霉素， 20 μg/mL X-gal以及0.1 mmol/LIPTG)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜.選取陽(yáng)性克隆保存于384 孔培養(yǎng)板，-70℃保存.

1.2.5BAC文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)

文庫(kù)建成后，隨機(jī)選取250個(gè)克隆分別接種到含氯霉素(12.5 mg/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以檢查插入片段大小與空載(無(wú)插入片段)比例.堿裂解法提取質(zhì)粒DNA后，用限制性內(nèi)切酶NotⅠ酶切，脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)插入片段大小.根據(jù)Clack 和Caron的經(jīng)驗(yàn)公式，計(jì)算BAC文庫(kù)的覆蓋率.

2結(jié)果與討論

本研究構(gòu)建的白眉長(zhǎng)臂猿BAC文庫(kù)共包含85 800個(gè)克隆.為了估計(jì)構(gòu)建的BAC文庫(kù)插入片段的大小，隨機(jī)挑選了250個(gè)克隆，提取質(zhì)粒DNA，NotI酶切后，經(jīng)脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè).檢測(cè)結(jié)果表明，2.4%的克隆插入片段小于60 kb，3.2%的克隆插入片段大于 180 kb，大約66%的克隆插入片段大小在100~160 kb之間，76.8%的克隆插入片段大于100 kb(圖1).所挑選的克隆平均插入片段大小約為110 kb，其中非重組克隆(無(wú)插入片段)數(shù)為25個(gè)，比率為10.0%.白眉長(zhǎng)臂猿基因組大小若按照3.0×106kb計(jì)算，根據(jù)估算的插入片段大小，本研究所構(gòu)建的BAC文庫(kù)大約覆蓋3倍的白眉長(zhǎng)臂猿基因組大小.

圖1　BAC克隆插入片段大小分布圖

構(gòu)建BAC文庫(kù)對(duì)于基因組較大的真核生物基因組學(xué)研究很重要，構(gòu)建過(guò)程復(fù)雜，操作的步驟較多，難度大，其中高質(zhì)量的高分子量基因組DNA的提取是整個(gè)文庫(kù)構(gòu)建中最關(guān)鍵的步驟，與片段的大小、克隆的效率、覆蓋率等有直接的關(guān)系.大片段DNA的選擇可以有效提高插入片段的大小和克隆的效率.在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，除酶切外，大片段DNA的操作全部在冰上進(jìn)行，同時(shí)使用廣口槍頭進(jìn)行移液，這樣可以有效防止DNA的物理?yè)p傷和降解.在進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳分離大片段DNA時(shí)，由于樣品的濃度高，一些小的DNA片段難免會(huì)嵌在大片段的DNA里，所以一般要采取多次分離的方法盡可能地去除小片段DNA.在本研究中，我們利用2次脈沖電泳分離回收的方法，盡可能地淘汰小片段DNA，以提高文庫(kù)目的片段的純度和濃度.

本文庫(kù)非重組克隆比率為10.0%，與高質(zhì)量BAC文庫(kù)相比，非重組克隆比率偏高.非重組克隆比率高一方面降低了文庫(kù)平均插入片段的大小，另一方面加大了后續(xù)的工作量，從而在整體上影響了文庫(kù)的質(zhì)量.影響文庫(kù)非重組克隆比率的因素有：(1)載體.制備載體時(shí)，由于EcoR I的星號(hào)活性，會(huì)造成一些非特異性的酶切位點(diǎn)，盡管這些非特異性的酶切位點(diǎn)比率非常低，但也會(huì)影響文庫(kù)的非重組克隆比率.(2)連接反應(yīng)的時(shí)間也會(huì)影響非重組克隆的比率.有文獻(xiàn)認(rèn)為4 h是連接的最佳反應(yīng)時(shí)間，超過(guò)4 h會(huì)增加非重組克隆的比率.(3)載體與基因組DNA的摩爾比應(yīng)該為10∶1至5∶1.

綜上所述，本研究所構(gòu)建的基因組BAC文庫(kù)，可以進(jìn)一步為白眉長(zhǎng)臂猿的基因組研究提供必備平臺(tái).

參考文獻(xiàn):

[1]藍(lán)道英,馬世來(lái),李壽昌,等.白眉長(zhǎng)臂猿鳴叫的時(shí)間特征[J].動(dòng)物學(xué)研究,1999,20(4):273-277.

[2]藍(lán)道英,馬世來(lái),韓聯(lián)憲.滇西白眉長(zhǎng)臂猿(Hylobateshoolock)分布、數(shù)量和保護(hù)[A].見(jiàn):張潔.中國(guó)獸類生物學(xué)研究[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1995:11-19.

[3]國(guó)家林業(yè)部和農(nóng)業(yè)部.國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄[S].1989.

[4]張興勇,白冰,艾懷森,等.云南高黎貢山自然保護(hù)區(qū)白眉長(zhǎng)臂猿種群及數(shù)量現(xiàn)狀初報(bào)[J].四川動(dòng)物,2007,26(4):856-858.

[5]范朋飛.中國(guó)長(zhǎng)臂猿科動(dòng)物的分類和保護(hù)現(xiàn)狀[J].獸類學(xué)報(bào),2012,32(3):248-258.

[6]張興勇,周偉,吳建普,等.高黎貢山赧亢白眉長(zhǎng)臂猿春季食物選擇[J].動(dòng)物學(xué)研究,2008,29(2):174-180.

[7]張亞平.長(zhǎng)臂猿的DNA序列進(jìn)化及其系統(tǒng)發(fā)育研究[J].遺傳學(xué),1997,24(3):231-237.

[8]Cao W, Fu B, Wu K, et al. Construction and characterization of three wheat bacterial artificial chromosome libraries[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(12): 21896-21912.

[9]Li R, Fan W, Tian G, et al. The sequence anddenovoassembly of the giant panda genome[J]. Nature, 2010, 463(7279): 311-317.

(責(zé)任編輯鄧穎)

Construction of Genome Bacterial Artificial Chromosome Library ofHylobatesHoolock

Wang QimingSun YechaoLi ShenjieYe Jianping

(School of Life Sciences, Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000)

Abstract：High quality genomic DNA ofHylobateshoolockwas obtained by gentle physical homogenization. The DNA was partially digested withEcoRⅠandEcoRⅠmethylase, and cloned to pCC1BAC vector. The positive clones were stored in 384-well plates. The constructed BAC library consists of 85800 clones. DNA from randomly selected 250 BAC clones was restricted withNotI restriction enzyme and fragments were separated by pulsed field gel electrophoresis. The result shows that the average insert size is estimated as approximately 110 kb, and the ratio of non-recombinant clones is 10.0%. If the genome size ofHylobateshoolockis 3×106kilobase, the library could cover 3 times the number of genome.

Key words：Hylobateshoolock; genomic library; bacterial artificial chromosome library

中圖分類號(hào)：Q953

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-293X(2015)10-0013-03

doi：10.16169/j.issn.1008-293x.k.2015.10.03

*收稿日期：2015-11-29基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LQ12C04002)

作者簡(jiǎn)介：王起明(1994-)，男，浙江臺(tái)州人，主要從事動(dòng)物學(xué)方面的研究.通訊作者：葉建平(1980-)，男，浙江衢州人，博士，講師，研究方向：動(dòng)物學(xué).E-mail：yejp02@126.com