祖祎祎,伊巴代提?喀迪爾,孫清鵬,潘金豹,盧敏

北京農(nóng)學院植物科學技術(shù)學院,北京102206

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高粱SbNAC0584基因克隆與表達分析

祖祎祎,伊巴代提?喀迪爾,孫清鵬,潘金豹,盧敏*

北京農(nóng)學院植物科學技術(shù)學院,北京102206

摘要:NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物體特有且在調(diào)控植物生長發(fā)育、抵抗逆境脅迫等方面具有重要生物功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。本研究從高粱中克隆得到一個受逆境脅迫誘導表達的NAC家族基因，系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明該基因與玉米Zma NAC0584親緣關(guān)系最近，故將其命名為SbNAC0584；SbNAC0584基因全長929 bp，編碼290個氨基酸，氨基酸序列比對結(jié)果表明SbNAC0584蛋白N-末端具有典型的NAC保守結(jié)構(gòu)域，C-末端為序列高度多樣性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域。采用實時熒光定量PCR技術(shù)分析SbNAC0584基因?qū)Σ煌巧锬婢趁{迫的應答模式，結(jié)果表明SbNAC0584受NaCl、脫水、PEG脅迫和植物激素ABA誘導表達上調(diào)，推測SbNAC0584在高粱非生物脅迫應答過程中發(fā)揮重要作用；組織特異性表達分析結(jié)果表明SbNAC0584在高粱旗葉和根中表達量相對較高。本研究為深入研究SbNAC0584的抗逆生物學功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:高粱;轉(zhuǎn)錄因子;克隆;非生物脅迫;表達

植物受到干旱、鹽堿和冷等非生物逆境脅迫損傷，其正常的生長發(fā)育將受到影響造成糧食減產(chǎn)。植物在長期進化過程中形成了有效的生理生化和分子作用機制來抵抗外界不良環(huán)境[1]。植物抗逆信號轉(zhuǎn)導途徑是涉及多基因共同作用的復雜調(diào)控體系，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子通過調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達來參與應答逆境脅迫。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)廣泛存在且特有的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[2]。NAC轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白的N-末端具有序列高度保守、參與DNA結(jié)合的NAC結(jié)構(gòu)域。蛋白C-末端為序列多樣性的轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域[3]?；诎被嵝蛄幸恢滦杂謱AC結(jié)構(gòu)域細分為5個相對保守的子結(jié)構(gòu)域。NAC蛋白在調(diào)控植物生長發(fā)育、抵抗生物和非生物逆境脅迫等過程中發(fā)揮重要作用[4]。近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展和植物基因組測序的完成，使得在植物全基因組水平上挖掘NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員成為可能[5-7]。水稻、擬南芥等模式植物中挖掘得到諸多受干旱、鹽堿、冷等非生物逆境脅迫和機械損傷、病原等生物逆境脅迫誘導表達顯著變化的NAC轉(zhuǎn)錄因子編碼基因。通過病毒誘導基因沉默（VIGS）技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，小麥TaNAC1作為負調(diào)控因子在抵抗小麥條銹病等方面發(fā)揮重要作用[8]。水稻SNAC1基因通過調(diào)控下游靶基因的表達提高了轉(zhuǎn)基因水稻的抗逆性，田間測產(chǎn)實驗結(jié)果表明干旱脅迫沒有造成SNAC1過表達轉(zhuǎn)基因水稻的減產(chǎn)[9]。NAC轉(zhuǎn)錄因子在依賴于ABA和不依賴于ABA的抗逆信號轉(zhuǎn)導途徑中均發(fā)揮重要作用，前人研究結(jié)果表明在依賴于ABA的信號途徑中存在OsNAC5、OsNAC052和SNAC2（OsNAC6）等NAC家族成員均在提高轉(zhuǎn)基因植株抗逆性方面具有重要的生物學功能[10-12]。其中水稻OsNAC5通過與OsNAC6和SNAC1蛋白相互作用從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，過表達OsNAC5能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱和耐鹽性。近年來，研究發(fā)現(xiàn)包括鷹嘴豆NAC家族成員CarNAC3、CarNAC6[13,14]，小麥TaNAC67、TaNAC2在內(nèi)等諸多NAC基因均參與植物非生物逆境脅迫應答[15,16]，但多數(shù)NAC基因的抗逆生物學功能特別是在重要耐旱作物高粱中參與植物逆境脅迫應答的相關(guān)研究較少。本研究從高粱耐旱自交系中克隆得到一個逆境脅迫應答基因SbNAC0584，對其進行序列比對和系統(tǒng)進化分析，并進一步分析其在不同非生物逆境脅迫及ABA處理下的誘導表達模式，明確其組織表達特異性，本研究為深入探明SbNAC0584的抗逆生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1植物材料與處理

選用的實驗材料為高粱耐旱自交系“XGL-1”，是由原中國農(nóng)業(yè)科學院品資所選育，種子由本實驗室保存。選取飽滿的高粱自交系“XGL-1”種子，分別用75%乙醇和0.5%次氯酸鈉對種子進行消毒，再用無菌水反復沖洗4~5遍，將種子種植于裝有蛭石和營養(yǎng)土混合花盆中（4~5株/盆），室溫（28℃）放置培養(yǎng)間（16 h光照/8 h黑暗）進行培養(yǎng)，待高粱長至三葉期時，配制Hoagland溶液，分別對高粱幼苗進行20%PEG、200 mM NaCl、脫水和100μM ABA (Sigma)處理，在材料處理同時對植株根部進行通氣，防止根系無氧呼吸，并在各處理0、1、3、6、12和24 h分別取植株地上和地下部分立即放置于液氮冷凍保存。

同時將高粱耐旱自交系“XGL-1”種植與北京農(nóng)學院實驗地，分別取高粱植株的根系、氣生根、葉片、穗、莖、旗葉6個不同組織進行基因的組織特異性表達分析，取材后立即放置液氮冷凍，－80℃保存。

1.2總RNA提取與第一鏈cDNA的合成

將低溫保存的樣品取出，在液氮中迅速研磨，直至樣品成粉末狀。主要參照TRIzol（Invitrogen）試劑盒提供的實驗方法提取高粱各樣品總RNA。電泳鑒定RNA的質(zhì)量，并用NanoDrop2000紫外分光光度計測定所提取RNA的濃度，放置于－80℃長期保存。高粱第一鏈cDNA的合成：用RNase free DNase I（Fermentas）消化樣品中的基因組DNA，并參照Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (＃K1622)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成高粱第一鏈cDNA，將原液放置于－20℃長期保存。

1.3SbNAC0584基因全長cDNA的克隆與序列分析

高粱基因組數(shù)據(jù)庫（http://genome.jgi-psf.org/）查詢高粱參考基因組序列，設(shè)計特異性引物FP （5'–AACATAGCGAGGGAGCCA - 3'）和RP（5' - CAGTTGAGCTGAATCCGTCC - 3'），以各處理混合的高粱cDNA為模板，PCR擴增SbNAC0584基因全長cDNA。擴增體系如下：ddH2O 9.5 μL，2×Trans Taq High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix 12.5 μL，F(xiàn)orward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，cDNA 1 μL。PCR擴增程序如下：95℃預變性5 min；95℃變性40 s；56℃退火30 s，72℃延伸2 min，32個循環(huán)后72℃延伸40 min。經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收，連接pMD18–T克隆載體（TaKaRa,大連），轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，挑取單菌落進行菌裂PCR檢測，選擇PCR檢測為陽性的克隆進行測序。

利用DNAMAN（Version 5.0）和ClustalX（Version 1.83）軟件進行基因序列比對。應用Contig Express（version 6.0; Invitrogen, Carlsbad, CA）軟件進行測序序列的拼接比對，采用MEGA4（version 4）軟件neighbor-joining（NJ）計算方法對SbNAC0584編碼蛋白及已報道的NAC家族成員進行氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化分析（brootstrap=1000）。

1.4實時熒光定量PCR分析

在基因3’末端非保守區(qū)設(shè)計針對SbNAC0584基因的特異性熒光定量(quantitative real-time PC R, qRT-PCR ) PCR引物：(FP：5’- ATGGAATCGGAGGCGTCG-3’，RP：5’- ATGTTGCCAAAGA AGTCGGC-3’），擴增片段長度251 bp。以高粱18S rRNA（FP：5’-GGCTCGAAGACGATCAGAT ACC-3’，RP：5’-TCGGCATCGTTTATGGTT-3’）為內(nèi)參基因?qū)悠穋DNA模板量進行校正，采用S YBR?Premix EX TaqTM染料和ABI7300 (Applied Biosystems, Foster City,美國)熒光定量PCR儀進行定量PCR分析，實時熒光定量PCR反應程序：94℃1 min , 94℃15 s, 56℃15 s, 72℃30 s，擴增40個循環(huán)，通過采用2-ΔΔCt法[17]分析基因的表達水平，脅迫誘導表達分析以0 h的相對表達量為1，組織表達特異性以中莖的表達量為參照（相對表達倍數(shù)為1），實驗進行三次生物重復，取平均值，計算標準差。表達倍數(shù)超過2倍認定為上調(diào)表達。

2　結(jié)果與分析

2.1SbNAC0584基因全長cDNA的克隆

如圖1所示，根據(jù)高粱參考序列設(shè)計引物，以高粱耐旱自交系“XGL-1”為材料，RT-PCR擴增獲得SbNAC0584基因全長cDNA（GenBank登錄號為KR809886），測序結(jié)果表明SbNAC0584基因全長929 bp，開放閱讀框（ORF）全長873 bp，共編碼290個氨基酸。

圖1　SbNAC0584全長cDNA擴增Fig.1 PCR amplification of the full-length cDNA of SbNAC0584

2.2氨基酸序列比對與系統(tǒng)進化分析

將擬南芥、小麥、大豆、水稻等植物中報道的已知功能的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因與高粱SbNAC0584蛋白序列進行多序列比對，結(jié)果表明SbNAC0584與包括擬南芥ATAF1、ATAF2、CUC1、NAM、水稻OsNAC052、大豆GmNAC20和小麥TaNAC69在內(nèi)的諸多參與非生物逆境脅迫應答的NAC家族蛋白序列特征具有高度相似性。如圖2所示，SbNAC0584蛋白的N-末端具有典型的且序列高度保守的NAC結(jié)構(gòu)（NAC-domain），基于氨基酸序列一致性又可將該結(jié)構(gòu)域分為5個子結(jié)構(gòu)域（A-E），其中B、D子結(jié)構(gòu)域主要參與DNA特異結(jié)合，而C-末端則是序列高度多樣性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制功能。

圖2　SbNAC0584與已知功能NAC家族的蛋白多序列比對Fig.2 Analysis on the sequence SbNAC0584 and some reported NAC proteins

為了進一步研究高粱SbNAC0584蛋白與其他NAC轉(zhuǎn)錄因子之間的親緣關(guān)系，將高粱SbNAC0584蛋白與已報道的擬南芥ATAF1、CUC3、GRAB1、玉米ZmaNAC0584、ZmSNAC1、水稻OsNAC052、大豆GmNAC2、GmNAC6和小麥TaNAC67、TaNAC4、TaNAC4a、TaNAC1、TaNAC8a等進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果表明高粱SbNAC0584蛋白與玉米ZmaNAC0584、玉米Zma054594的氨基酸序列一致性分別為88.67 %和87.79 %（圖3），由此判斷高粱SbNAC0584是玉米ZmaNAC0584的同源基因，兩者同為逆境脅迫應答相關(guān)的NAC家族成員。

圖3　SbNAC0584與已知功能的脅迫應答相關(guān)的NAC家族成員進化分析Fig.3 Phylogenetic relationship between SbNAC0584 and stress-responsive NAC proteins

2.3SbNAC0584基因脅迫誘導表達分析

圖4　200 mM NaCl、脫水、20 % PEG和100μM植物激素ABA脅迫下(A-D)SbNAC0584的相對表達量Fig.4ExpressionofSbNAC0584inSorghum,under200mMNaCl,dehydration,20%PEG,ABAstressconditions(A-D),respectively

如圖3所示，系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明SbNAC0584與諸多已知功能的NAC家族成員的親緣關(guān)系較近，為了進一步研究SbNAC0584基因在非生物逆境脅迫和ABA脅迫下的誘導表達模式，分別對三葉期高粱自交系進行NaCl、脫水、PEG和植物激素ABA脅迫處理，分析SbNAC0584在不同處理下的表達水平。結(jié)果表明在NaCl脅迫下，SbNAC0584基因在高粱地下部誘導表達顯著上調(diào)，至處理24 h時表達量達到最大（約3倍），而地上部表達量隨脅迫處理時間變化沒有顯著差異。SbNAC0584 受20 % PEG脅迫處理誘導表達上調(diào)，在地下部處理3 h時上調(diào)表達2.05倍，處理6 h時表達量達到最大（約4倍），處理12 h時表達量開始降低（約3.7倍）。在脫水脅迫處理下，SbNAC0584在高粱地下部呈快速誘導表達上調(diào)模式，在處理3 h時達到最大（2.3倍）。同時，檢測到SbNAC0584在轉(zhuǎn)錄水平上應答外源植物激素ABA脅迫，最高上調(diào)表達15倍。

2.4SbNAC0584基因組織特異性表達分析

如圖5所示，qRT-PCR分析結(jié)果表明，SbNAC0584在檢測的所有的組織（根系、氣生根、葉片、穗、莖、旗葉）中均有表達，但在高粱氣生根和旗葉中的表達量較其它組織相對較高，其次是在根中，在高粱莖和穗中的表達水平相對較低。

圖5　SbNAC0584的組織特異性表達分析Fig.5 Tissue-specific expression of SbNAC0584 in sorghum

3　討論

近年來，NAC基因作為植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，因其在調(diào)控植物生長發(fā)育和抵抗非生物和生物逆境脅迫等方面發(fā)揮的重要功能受到研究者廣泛關(guān)注[18]。目前，通過分子生物學手段挖掘到包括擬南芥、水稻和煙草等模式植物在內(nèi)的諸多具有重要生物學功能的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員，它們通過蛋白互作或調(diào)控下游靶基因的表達來調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育進程和適應外界不良環(huán)境。然而在重要禾谷類作物高粱中NAC基因與抗逆相關(guān)的報道較少。

本研究從高粱耐旱自交系中克隆得到一個NAC家族基因，SbNAC0584基因cDNA全長929 bp，ORF全長873 bp，編碼290個氨基酸。與擬南芥、水稻、小麥和大豆等作物中的NAC家族蛋白氨基酸序列特征相一致，SbNAC0584蛋白的N-末端具有高度保守的NAC-domain（約160個氨基酸），蛋白C-末端為序列多樣性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域。基因結(jié)構(gòu)的保守性、進化的相似性往往決定了基因功能的相關(guān)性。前人研究結(jié)果表明，過表達小麥脅迫誘導表達基因TaNAC67能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因小麥的抗旱性[15]，玉米ZmaNAC0584和Zma054594受多種非生物逆境脅迫和植物激素ABA誘導表達顯著上調(diào)[18]，而高粱SbNAC0584作為與三者親緣關(guān)系較近的基因，其受到脫水、NaCl、PEG脅迫誘導表達顯著上調(diào)（圖4），表明SbNAC0584很可能在高粱抵抗外界不良環(huán)境脅迫、提高植株抗逆性方法發(fā)揮重要作用。另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)在植物激素ABA脅迫處理下，SbNAC0584基因表達顯著上調(diào)，ABA作為重要的信號分子參與調(diào)控氣孔開閉等植物的抗逆過程，表明高粱SbNAC0584蛋白可能依賴于ABA的抗逆信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

NAC轉(zhuǎn)錄因子基因在植物生長發(fā)育不同階段不同組織中的表達量各不相同，例如在干旱脅迫處理下水稻SNAC1在植株根中和有保衛(wèi)細胞組成的氣孔中誘導表達，而在葉舌、雄穗和花絲組織的表達量沒有顯著變化[9]。擬南芥NAC1基因在植物根中表達水平最高，在莖和葉中表達水平相對較低。NAC家族基因的組織表達特異性表明其在植物體不同組織和器官中潛在的作用機制存在差異。

SbNAC0584蛋白在高粱氣生根和旗葉中的相對表達量較高，玉米ZmaNAC0584和Zma054594的組織表達分析結(jié)果同樣證明這兩個基因在植物根中的表達量相對較高，而植物根系是其響應并適應外界不良環(huán)境的關(guān)鍵部位，其生理特性和滲透調(diào)節(jié)能力與作物的抗逆性之間有緊密關(guān)聯(lián)。

本研究克隆高粱SbNAC0584基因全長cDNA，對其進行序列和系統(tǒng)進化分析，解析其在非生物逆境脅迫和植物激素ABA處理下的誘導表達模式和組織表達特異性，為進一步深入研究SbNAC0584抗逆相關(guān)生物學功能和潛在的分子作用機制奠定基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

克隆高粱NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因SbNAC0584，該基因與諸多逆境脅迫應答相關(guān)的NAC基因親緣關(guān)系較近，在氣生根和旗葉中表達量相對較高，且受非生物逆境脅迫NaCl、脫水、PEG和植物激素ABA誘導表達上調(diào)，表明SbNAC0584可能在依賴于ABA的信號途徑中參與應答非生物逆境脅迫。

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The Analysis on the Cloning and Expression of SbNAC0584 Gene in Sorghum bicolor L.

ZU Yi-yi, Kadier?Yibadaiti, SUN Qing-peng, PAN Jin-bao, LU Min*

College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China

Abstract:NAC proteins are plant-specific transcription factors that play important role in abiotic stress adaptations and tolerance, as well as in the plant processes in development. In this study, by searching against the plant genome databases, a stress induced NAC member was isolated from sorghum. It was designed as SbNAC0584 for its close relationship with maize ZmaNAC0584. The full-length cDNA of SbNAC0584 was 929 bp that encoded 290 amino acids. Sequence analysis indicated that a NAC conserved domain was localized in the N-terminal region of the SbNAC0584 protein. A highly diverse sequence was also observed in the C terminus. Transcription analyses were carried out to determine the effects of various abiotic stresses and of the phytohormone ABA on the expression of the SbNAC0584. SbNAC0584 was significantly induced by NaCl, dehydration, PEG and ABA treatments. We speculated that it might be involved in the response to abiotic stresses. The spatial expression pattern of SbNAC0584 revealed that higher transcripts existed in the root and flag leaf of sorghum plants than those in other tissues. This information provides a background for the further functional study of SbNAC0584.

Keywords:Sorghum bicolor L.; transcription factor; cloning; abiotic stress; expression

*通訊作者:Author for correspondence. E-mail:lumin.sdau@gmail.com

作者簡介:祖祎祎、伊巴代提?喀迪爾,女,碩士研究生,從事作物遺傳育種研究. E-mail:13691112388@163.com

基金項目:北京市教委科研計劃面上項目(KM201510020003)

收稿日期:2015-05-23修回日期: 2015-06-23

中圖法分類號:Q781

文獻標識碼:A

文章編號:1000-2324(2015)04-0497-06