馮立國,巴金磊,韋軍,孟祥毅,生利霞

揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州225009

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兩種砂梨果實(shí)香氣成分分析及其相關(guān)基因PpAAT的克隆與表達(dá)分析

馮立國,巴金磊,韋軍,孟祥毅,生利霞*

揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州225009

摘要:梨（Pyrus spp）是深受國內(nèi)外消費(fèi)者喜愛的水果，果實(shí)香氣是果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是吸引消費(fèi)者和增強(qiáng)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的主要因素之一。本文以砂梨品種‘二十世紀(jì)’及其芽變品種‘金二十世紀(jì)’為試材，研究了其果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期香氣成分的差異，克隆獲得了梨果實(shí)香氣成分合成相關(guān)的醇?；D(zhuǎn)移酶基因（PpAAT），分析了該基因在梨果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期及不同部位中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明：‘二十世紀(jì)’綠熟期、商熟期和完熟期果實(shí)的主要香氣成分均為己醛，‘金二十世紀(jì)’綠熟期果實(shí)的主要香氣成分同樣是己醛，但商熟期果實(shí)中己酸乙酯的含量迅速增加，成為主要香氣成分，完熟期時(shí)含量進(jìn)一步增加，高含量的酯類化合物可能是‘金二十世紀(jì)’具有濃郁香氣的主要原因；隨著果實(shí)的成熟，PpAAT基因在‘金二十世紀(jì)’果皮中的表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢(shì)，綠熟期表達(dá)量最高，商熟期表達(dá)量開始降低，完熟期表達(dá)量非常弱；PpAAT在果肉中的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在商熟期果肉中表達(dá)量最高，綠熟期果肉中次之，完熟期果肉中的表達(dá)量最低?？傮w上，PpAAT基因在商熟期的表達(dá)量高于綠熟期和完熟期，在果皮中的表達(dá)量高于果肉。

關(guān)鍵詞:砂梨;果實(shí)香氣;醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因;克隆與表達(dá)

梨（Pyrus spp）是世界上廣泛栽培的重要果品之一，果實(shí)多汁，味甜肉脆，富含VC和多種對(duì)人體有益的微量元素[1,2]，深受國內(nèi)外消費(fèi)者喜愛。當(dāng)前，隨著消費(fèi)者對(duì)梨果實(shí)品質(zhì)的要求不斷提高，品質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)日漸激烈，果品生產(chǎn)由數(shù)量型轉(zhuǎn)向質(zhì)量型。梨果實(shí)的內(nèi)在品質(zhì)主要決定于果實(shí)風(fēng)味、肉質(zhì)、香氣等方面，薄壁細(xì)胞、石細(xì)胞、礦質(zhì)元素、糖、酸、香氣是評(píng)價(jià)梨果實(shí)品質(zhì)的幾個(gè)重要指標(biāo)[3]。果實(shí)香氣主要來源于是果實(shí)中各種微量的揮發(fā)性物質(zhì)，它們對(duì)果品的風(fēng)味起著重要的作用[4]，是構(gòu)成果品加工和鮮食的主要因素[5-10]，也是吸引消費(fèi)者和增強(qiáng)果品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的主要因素之一。

梨種質(zhì)資源極為豐富，砂梨（P. pyrifalia）是原產(chǎn)中國南方和日本的梨栽培種之一，近幾十年來，中國、日本、韓國先后育成了一大批優(yōu)良的砂梨品種，其果實(shí)碩大，肉質(zhì)細(xì)嫩，果實(shí)顏色和成熟期多樣，內(nèi)在和外觀品質(zhì)優(yōu)良，但其果實(shí)香氣清淡，香氣品質(zhì)欠佳。因此，充分利用國內(nèi)外豐富的砂梨種質(zhì)資源，尋找和挖掘果實(shí)香氣濃郁的砂梨資源，弄清其特異香氣成分及含量，并進(jìn)而研究它們?cè)诶婀麑?shí)中的代謝與調(diào)節(jié)機(jī)制是一項(xiàng)具有重要價(jià)值的研究課題，將為香氣濃郁的砂梨品種選育提供重要基礎(chǔ)。

目前，有關(guān)砂梨果實(shí)香氣的研究得到了越來越多學(xué)者的關(guān)注，但主要集中在不同品種、不同成熟期果實(shí)香氣成分分析及香氣形成與代謝關(guān)鍵酶活性的研究方面[1, 5-7]，分子水平的研究較少?！鸲兰o(jì)’梨是日本育種家西田光夫通過對(duì)砂梨品種‘二十世紀(jì)’進(jìn)行輻射誘變成選育出的芽變品種，與‘二十世紀(jì)’相比，其果皮在商熟期之前呈淡黃綠色，但完熟期變?yōu)槿辄S色，品質(zhì)上乘，且具有濃郁的香氣，是研究砂梨果實(shí)香氣的極佳試驗(yàn)材料。本研究首先測(cè)定‘二十世紀(jì)’和‘金二十世紀(jì)’不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)香氣成分的差異，明確導(dǎo)致‘金二十世紀(jì)’果香濃郁的特異香氣成分，然后結(jié)合該特異香氣成分的生物合成途徑，克隆與其特異香氣成分生物合成相關(guān)的PpAAT基因，分析了該基因在其不同果實(shí)發(fā)育時(shí)期和果實(shí)不同部位的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，旨在為梨果實(shí)香氣品質(zhì)的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

砂梨品種‘二十世紀(jì)’和‘金二十世紀(jì)’種植于揚(yáng)州大學(xué)教學(xué)果園，土壤為壤土，微堿性。樹齡10年，株行距3 m×4 m，雙層棚架栽培，上層架面高度1.7 m，下層架面高度0.9 m，樹勢(shì)中庸，長勢(shì)一致，肥水等管理水平較好。根據(jù)果實(shí)發(fā)育時(shí)期和成熟程度，分別在綠熟期（7月25日，花后115 d）、商熟期（8月18日，花后138 d）和完熟期（8月30日，花后150 d）采摘果實(shí)。每個(gè)品種隨機(jī)選擇3株，每株隨機(jī)采摘3個(gè)表面完好、無病蟲害、成熟度一致的果實(shí)，采摘后置于冰盒中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，立即開始果實(shí)香氣成分分析。

采摘商熟期‘金二十世紀(jì)’果實(shí)3個(gè)，冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，四分法去皮去核后，迅速切成小塊，液氮研磨后后置于-80℃超低溫冰箱保存，用于PpAAT基因的克隆。

分別在綠熟期、商熟期和完熟期采摘‘金二十世紀(jì)’果實(shí)用于PpAAT基因的時(shí)空表達(dá)分析。隨機(jī)選擇3株，每株隨機(jī)采摘3個(gè)健康果實(shí)，將每株的果實(shí)迅速分為果皮和果肉兩個(gè)部分，分別混勻，液氮迅速研磨后后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，單株重?fù)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1香氣成分萃取與分析測(cè)樣前先將固相微萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口老化20 min，老化溫度250℃。采用四分法將3個(gè)果實(shí)去除果核后，切碎，混勻，稱量樣品25 g放入榨汁機(jī)壓榨。取新榨梨勻漿8 mL于100 mL的樣品瓶內(nèi)，加入6.0 g NaCI（使香氣成分充分揮發(fā)），并用鋁箔紙及進(jìn)口封口膜密封，將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于40℃（水?。l件下吸附40 min。

吸附完成后將固相微萃取頭抽回，插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Trace DSQ,美國Thermo公司），于250℃解吸2 min，啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。色譜條件: FFAP彈性石英毛細(xì)管色譜柱，長60 m，內(nèi)徑0. 32 mm，液膜厚1.0 μm；載氣為He (99. 99% )，不分流；程序升溫，進(jìn)樣口250℃，柱溫起始溫度50℃保持1 min，以5℃/min升溫至120℃，再以8℃/min升溫至200℃，最后以12℃/min升溫至250℃保持7 min。質(zhì)譜條件: GC-MS接口溫度250℃，離子源溫度200℃，電離方式EI，電子能量70 eV，發(fā)射電流200 μA；掃描質(zhì)量范圍29~600 amu。各組分經(jīng)過計(jì)算機(jī)NIST2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索及資料分析，通過峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。三次重復(fù)。

1.2.2基因克隆與表達(dá)分析

1.2.2.1總RNA的提取與純化總RNA的提取參照本實(shí)驗(yàn)室已建立的改良CTAB法進(jìn)行?？俁NA的純化采用DNaseⅠ試劑盒，具體操作參照其說明書進(jìn)行。

1.2.2.2引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增根據(jù)GenBank中其它植物AAT基因序列的保守區(qū)域，運(yùn)用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物用于3′端的擴(kuò)增，根據(jù)所得到的3′端序列設(shè)計(jì)5′端擴(kuò)增引物，擴(kuò)增獲得PpAAT基因全長，并設(shè)計(jì)用于表達(dá)分析的基因特異性引物。Actin參照鴨梨肌動(dòng)蛋白基因（表1）。PpAAT基因擴(kuò)增反應(yīng)參照3′-Full RACE Core Set Kit和5′-Full RACE Core Set Kit說明書進(jìn)行。基因表達(dá)分析采用半定量PCR（RT-PCR）技術(shù)，具體參照陳陳[8]的方法進(jìn)行。三次重復(fù)。

表1　用于梨PpAAT基因擴(kuò)增和表達(dá)分析的引物Table 1 Primers used for isolation and expression analysis of PpAAT gene in pear

1.2.2.3序列分析利用DNAMAN 5.0軟件進(jìn)行全長cDNA序列分析；利用GenBank BLAST進(jìn)行氨基酸序列的同源性分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。

2　結(jié)果與分析

2.1‘二十世紀(jì)’和‘金二十世紀(jì)’不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)香氣成分分析

GC-MS分析結(jié)果表明（表2），‘二十世紀(jì)’綠熟期、商熟期和完熟期分別檢出22種、19種和17種香氣成分，‘金二十世紀(jì)’綠熟期、‘商熟期、完熟期的果實(shí)中分別鑒定出13種、18種和20種香氣成分。

表2　‘二十世紀(jì)’與‘金二十世紀(jì)’不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的香氣成分及其相對(duì)含量Table2Thevolatilecompoundsandtheirrelativeamountsof‘Ershishiji’and‘Jinershishiji’pearindifferentdevelopmentalstages

-未檢測(cè)到- Not detected.

綠熟期，‘二十世紀(jì)’和‘金二十世紀(jì)’果實(shí)揮發(fā)性成分中醛類含量最高，其相對(duì)含量分別達(dá)到了62.98%和74.56%，含量最多的香氣成分是己醛，相對(duì)含量分別為37.73%和59.77%。

商熟期，‘二十世紀(jì)’醛類含量最高，其相對(duì)含量達(dá)到了48.26%，是主要香氣成分。含量最多的香氣成分是己醛，相對(duì)含量為20.78%，(4z)-4-乙酸己烯酯和壬醛的含量也較高，占芳香物質(zhì)總量12.55%和13.93%。而‘金二十世紀(jì)’商熟期酯類含量最高，其相對(duì)含量達(dá)到了82.86%，是主要香氣成分，含量最多的香氣成分是己酸乙酯，相對(duì)含量為54.58%。

‘二十世紀(jì)’完熟期仍然是醛類含量最高，相對(duì)含量達(dá)到了72.53%。含量最多的香氣成分是己醛，相對(duì)含量為54.33%，乙酸乙酯的含量也較高，占芳香物質(zhì)總量15.34%。而‘金二十世紀(jì)’完熟期酯類含量最高，其相對(duì)含量達(dá)到了90.12%，含量最多的香氣成分是己酸乙酯，相對(duì)含量為70.53%。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，‘二十世紀(jì)’綠熟期、商熟期和完熟期果實(shí)的主要香氣成分均為己醛，‘金二十世紀(jì)’綠熟期果實(shí)的主要香氣成分同樣是己醛，但商熟期果實(shí)中己酸乙酯的含量迅速增加，成為主要香氣成分，完熟期時(shí)含量進(jìn)一步增加，達(dá)70.53%，這可能也是其具有濃郁香氣的主要原因。

2.2‘金二十世紀(jì)’果實(shí)特異香氣相關(guān)PpAAT基因的克隆與序列分析

以‘金二十世紀(jì)’梨果實(shí)中所提取的RNA為模板，采用RACE方法進(jìn)行3′和5′端cDNA片段的擴(kuò)增，得到PpAAT基因cDNA全長序列。該cDNA全長1648 bp，具有起始密碼子、完整的開放閱讀框（1316 bp）、5′非編碼區(qū)（79 bp）、終止密碼子、3′非編碼區(qū)（242 bp）和poly(A)尾巴（11 bp），共編碼473個(gè)氨基酸。該基因登錄號(hào)為KF887152，并將其命名為PpAAT（圖1）。

圖1　梨PpAAT基因核酸序列及推斷的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of PpAAT gene of pear

通過NCBI同源性搜索，并繪制同源樹（圖2），顯示該基因序列與蘋果（AY512893.1）、枇杷（KF704125.1）、杏（EU784138.1）、橙（NM_001288910.1）等植物AAT基因核苷酸序列的同源性分別達(dá)96%、95%、71%、67%，推導(dǎo)出來，該基因的氨基酸序列與蘋果（AGW30203.1）、枇杷（AHC32224.1）、橙（NP_001275839.1）、草莓（AEM43830.1）等植物AAT基因氨基酸序列的同源性分別達(dá)94%、91%、57%、62%。

圖2　梨PpAAT基因氨基酸序列與其他植物同源序列的同源樹Fig.2 Amino acid sequence of PpAAT gene and other plants in homology tree

2.3PpAAT在‘金二十世紀(jì)’梨果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期及不同部位中的表達(dá)分析

如圖3所示，隨著果實(shí)的成熟，PpAAT基因在果皮中的表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢(shì)，綠熟期（A）表達(dá)量最高，商熟期（C）表達(dá)量開始降低，完熟期（E）表達(dá)量非常弱。同樣分析發(fā)現(xiàn)，PpAAT在果肉中的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在商熟期果肉（D）中表達(dá)量最高，綠熟期果肉（B）中次之，完熟期果肉（F）中的表達(dá)量最低?？傮w來看，PpAAT基因在商熟期的表達(dá)量高于綠熟期和完熟期，在果皮中的表達(dá)量高于果肉。

圖3　不同發(fā)育時(shí)期及不同部位‘金二十世紀(jì)’果實(shí)中PpAAT基因的半定量表達(dá)水平Fig.3 Expression level of PpAAT gene in different developmental stages and different part of pear by RT-PCR

3　討論

味感物質(zhì)（糖、酸等）和嗅感物質(zhì)（香味物質(zhì)）構(gòu)成果實(shí)的風(fēng)味物質(zhì)或果實(shí)風(fēng)味復(fù)合物，其組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)有重要影響[9,10]。前人研究表明，砂梨果實(shí)的主要香氣成分為己醛和2-己烯醛[1,5]，而醛類化合物在感官上是清香型果香，香氣淡。本研究表明，‘金二十世紀(jì)’綠熟期果實(shí)的主要香氣成分同樣為己醛，但商熟期之后，其果實(shí)中己酸乙酯等酯類化合物的相對(duì)含量迅速增加，成為主要香氣成分。酯類化合物是具有愉悅的濃香型果香的一類化合物，因此，高含量的酯類化合物可能是‘金二十世紀(jì)’具有濃郁香氣的主要原因。

研究表明，酯類揮發(fā)性成分作為果實(shí)特征香氣中最重要的組分之一，多種酶參與了其代謝的調(diào)控。酯類物質(zhì)是以脂肪酸[11]和特定氨基酸[12,13]為前體代謝產(chǎn)生的。脂肪酸通過β-氧化過程產(chǎn)生乙酸、丁酸和己酸，然后還原為相應(yīng)的醇類，這些醇在?；鵆oA存在的情況下，通過醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）的作用酯化為酯[14]，醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）基因是該途徑最后一步的關(guān)鍵基因。為此，本研究采用RACE方法從酯香濃郁的‘金二十世紀(jì)’梨果實(shí)中克隆獲得了PpAAT基因，并研究了其在梨果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期及不同部位中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)pAAT基因在商熟期和綠熟期的表達(dá)量較高，但在完熟期開始迅速降低。香氣檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示（表2），‘金二十世紀(jì)’在綠熟期、商熟期和完熟期酯類物質(zhì)相對(duì)含量分別為15.79%、82.86%和90.12%，即從綠熟期到完熟期時(shí)酯類化合物含量逐漸上升，其變化趨勢(shì)與PpAAT表達(dá)量的變化不完全同步，究其原因，可能是由于PpAAT基因從綠熟期到商熟期表達(dá)逐漸較強(qiáng)，促進(jìn)了乙酸己酯、己酸乙酯等酯類物質(zhì)在此期間不斷形成和積累，至完熟期時(shí)酯類物質(zhì)積累量達(dá)到最高。但隨著果實(shí)成熟進(jìn)程推進(jìn)，酯類物質(zhì)合成前體不斷消耗，最終導(dǎo)致PpAAT基因的表達(dá)量在完熟期時(shí)降至最低。但有關(guān)AAT酶活性變化與PpAAT基因表達(dá)之間的因果關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

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Analysis on Aromatic Constituents from Two P. pyrifalia Cultivars and the Cloning and Expression of the relevant PpAAT Gene

FENG Li-guo, BAJin-lei, WEI Jun, MENG Xiang-yi, SHENG Li-xia*

College of Horticulture and Plant Protection/Yangzhou University, Yangzhou 225009, China

Abstract:Pyrus spp is a very popular fruit in the world. Fruit aroma is an important index of fruit quality, it is also a main factor of attracting consumers and strengthening market competitiveness. In this paper, the volatile compounds of the fruit of P. pyrifalia‘Er shi shi ji’and P. pyrifalia‘Jin er shi shi ji’in different developmental stages (green stage, commercial stage and ripe stage) were studied by GC-MS. Then the full sequence of alcohol acyltransferase (PpAAT) gene which related to the biosynthesis of aromatic compounds in pear were cloned by RACE method, and the expression patterns of PpAAT gene in different developmental stages and different organs of pear fruits were analyzed by RT-PCR. The results showed that hexanal was the main aromatic compounds of‘Er shi shi ji’in 3 different mature stages of fruit, so the green stage of‘Jin er shi shi ji’, but ethyl caproate became the main aromatic compounds of‘Jin er shi shi ji’in commercial stage, and its amount further increased in the full ripe stage. The high amounts of esters may be the main reason for the rich aroma of‘Jin er shi shi ji’; We also found that the expression level of PpAAT gene gradually declined along with fruit riping in pear pericarp of‘Jin er shi shi ji’, which reached the highest level in the green stage, and started to drop from the commercial stage, then dropped rapidly at ripe stage. The expression level of PpAAT gene in pear sarcocarp firstly increased from green stage to commercial stage, and then dropped rapidly in ripe stage. As a whole, the expression level of PpAAT gene in commercial stage was higher than which in the other two stages, and it was also higher in the pericarp than in the sarcocarp.

Keywords:Pear fruit; aromatic constituents; alcohol acyltransferase; cloning and gene expression

*通訊作者:Author for correspondence. E-mail:lxsheng@yzu.edu.cn

作者簡介:馮立國(1979-),男,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事園藝植物種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究. E-mail:lgfeng@yzu.edu.cn

基金項(xiàng)目:江蘇省林業(yè)三新工程項(xiàng)目(LYSX[2014]43)

收稿日期:2015-05-14修回日期: 2015-05-25

中圖法分類號(hào):S661.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-2324(2015)04-0491-06