趙軍林,叢紅滋,蘇長(zhǎng)躍,于喜艷,王秀峰

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院,作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安271018

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甜瓜果實(shí)八氫番茄紅素脫氫酶基因(CmPDS)的克隆與表達(dá)

趙軍林,叢紅滋,蘇長(zhǎng)躍,于喜艷,王秀峰*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院,作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安271018

摘要:以甜瓜自交系‘M01-3’果實(shí)cDNA為模板，采用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆了甜瓜果實(shí)八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）基因cDNA全長(zhǎng)序列，命名為CmPDS（基因注冊(cè)號(hào)：KC507802）。序列分析表明，該基因有開放閱讀框1731 bp，編碼576個(gè)氨基酸，與其他植物PDS氨基酸序列具有較高的同源性，尤其與黃瓜、南瓜、苦瓜PDS氨基酸序列高達(dá)92.6% ~ 87.8%。熒光定量分析表明，該基因在甜瓜不同器官中均有表達(dá)，在葉片和授粉后25 d的果實(shí)中表達(dá)量較高，在根中表達(dá)量最低；隨果實(shí)發(fā)育成熟，該基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞:甜瓜; PDS基因;克隆;表達(dá)

甜瓜（Cucumis melo L.）是一種世界廣泛栽培的園藝作物，是世界公認(rèn)的十大健康水果之一，其果實(shí)含大量碳水化合物、檸檬酸和類胡蘿卜素，可消暑清熱、生津解渴[1]。甜瓜果肉顏色主要有黃色、橙色、綠色和白色，形成甜瓜果肉顏色的色素主要是葉綠素和類胡蘿卜素[2]，類胡蘿卜素是廣泛存在于植物及微生物中的一大類色素，能賦予植物花和果實(shí)黃色、橙色和紅色等顏色[3]。光合作用中，類胡蘿卜素具有吸收光能，以非輻射的方式耗散過剩能量，保護(hù)反應(yīng)中心的重要作用。營(yíng)養(yǎng)方面，類胡蘿卜素具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、增進(jìn)細(xì)胞間聯(lián)接交流、預(yù)防、延緩及治療癌癥的功能；類胡蘿卜素還是維生素A的前體[4-7]，人體自身不能合成類胡蘿卜素，主要依賴飲食供應(yīng)。

八氫番茄紅素脫氫酶（Phytoene desaturase, PDS）是類胡蘿卜素合成途徑中重要的限速酶，催化八氫番茄紅素向ζ-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化。Chamovitz等從抗達(dá)草滅的組囊藻R2突變體中分離到發(fā)生了點(diǎn)突變的PDS，繼而從非突變體中獲得正常PDS，之后他們以此基因?yàn)樘结樂蛛x到大豆和番茄PDS[8-10]。Yan P等人克隆了番木瓜PDS，該基因全長(zhǎng)2096 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)為1716 bp的CDS區(qū)，并研究發(fā)現(xiàn)隨番木瓜果實(shí)成熟，該基因的表達(dá)量增加[11]。到目前為止，番茄、煙草和擬南芥等植物中PDS研究已有報(bào)道，而甜瓜胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的研究主要集中在上游的八氫番茄紅素合成酶（PSY）基因，對(duì)參與脫氫反應(yīng)的酶基因研究較少。本試驗(yàn)旨在以厚皮甜瓜自交系‘M01-3’為材料，克隆甜瓜PDS全長(zhǎng)序列，并且進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究該基因在甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為本實(shí)驗(yàn)室選育的白色果肉厚皮甜瓜自交系‘M01-3’。于2012年2月25日播種育苗，4月1日定植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站日光溫室內(nèi)，開花后人工授粉，嚴(yán)格控制自交，常規(guī)栽培管理。

質(zhì)粒和大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T和熒光定量試劑盒等購自大連寶生物公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2基因克隆與生物信息學(xué)分析

根據(jù)自交系‘M01-3’果實(shí)發(fā)育期（30 d左右），取授粉后15 d迅速生長(zhǎng)的甜瓜果實(shí)，采用LiCl沉淀法[12]提取總RNA，以提取的總RNA為模板，用大連寶生物公司的RNA PCR（AMV）Ver2.1反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

根據(jù)其他植物PDS序列（黃瓜：XM_004156918；南瓜：JN253178；苦瓜：AY494790）設(shè)計(jì)引物P1和P2（表1）擴(kuò)增中間片段。根據(jù)中間片段序列測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)1條3’上游基因特異引物GSP1，與通用引物B26擴(kuò)增3’端序列。PCR擴(kuò)增條件為：94℃4 min；94℃45 s，56℃45 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

用末端轉(zhuǎn)移酶TdT給cDNA加尾，根據(jù)中間片段序列設(shè)計(jì)基因特異性引物GSP2和GSP3，與通用引物AUAP和AAP（表1）做巢式PCR擴(kuò)增5’端序列。巢式PCR擴(kuò)增條件：用GSP2與AUAP做第1輪PCR：94℃4 min；94℃45 s，60℃50 s，72℃90 s，20個(gè)循環(huán)；72℃10 min；以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，用GSP3與AUAP做第2輪PCR：94℃4 min；94℃45 s，58℃50 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

對(duì)得到的序列拼接，在兩端UTR區(qū)設(shè)計(jì)引物HP1和HP2（表1）擴(kuò)增PDS全長(zhǎng)。PCR條件：95℃5 min；95℃45 s，58℃45 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

利用DNAMan、Bioedit、MEGA4、Tmpred、SPOMA等分子生物學(xué)軟件對(duì)克隆的甜瓜PDS全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析。

表1　PCR引物Table 1 Primers used in PCR

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用Trizol法分別提取盛花期甜瓜根、莖、葉、花以及不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。內(nèi)參基因參照Hui Hao等[13]選擇actin gene（GenBank：FJ763186）。內(nèi)參引物序列為EF-R和EF-F；目的基因引物序列為PDS-R和PDS-F（表1）。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3 min；94℃10 s，60℃30 s，72℃10 s，40個(gè)循環(huán)，參照Livak和Schmittgen[14]的方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果與分析

2.1甜瓜果實(shí)PDS基因的克隆

以甜瓜果實(shí)總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用P1和P2擴(kuò)增中間片段，得到約1200 bp的條帶（圖1，A），與目的條帶大小相仿。經(jīng)測(cè)序比對(duì)，該片段即為目的片段，全長(zhǎng)1216 bp。

用GSP1和通用引物B26擴(kuò)增，得到約400 bp的條帶（圖1，D），與目標(biāo)條帶長(zhǎng)度相近，經(jīng)測(cè)序比對(duì)，該片段即為3’端片段，長(zhǎng)395 bp。

用GSP2和通用引物AAP做第1輪PCR，電泳檢測(cè)未出現(xiàn)目標(biāo)條帶。以第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用GSP3和通用引物AUAP做第2輪PCR，電泳檢測(cè)顯示在600 bp處獲得特異性條帶（圖1，B）。經(jīng)測(cè)序比對(duì)，該序列與中間片段序列有135 bp重疊，證明該片段為甜瓜果實(shí)PDS 5’端。

用HP1和HP2擴(kuò)增，得到約1900 bp特異條帶（圖1，C），測(cè)序比對(duì)確定該序列為目的基因。

圖1　甜瓜PDS的PCR擴(kuò)增Fig.1 Agarose gel electrophoresis for the cloning of PDS from melon

2.2CmPDS序列分析

將獲得的1906 bp甜瓜PDS全長(zhǎng)序列，命名為CmPDS。將該cDNA序列提交GenBank，登錄號(hào)為KC507802。該cDNA包含1個(gè)完整的開放閱讀框（126~1856），編碼576個(gè)氨基酸。

經(jīng)BLAST分析，CmPDS cDNA序列與黃瓜PDS的同源性高達(dá)97%，與南瓜為96%，與苦瓜為92%，與花蓖麻、番木瓜、甜橙、番紅花等同源性在79% ~ 83%之間。

推導(dǎo)的氨基酸序列分子量為64 kDa，pI為7.1。利用Tmpred軟件對(duì)其在質(zhì)體膜上可能的跨膜拓?fù)鋵W(xué)模型的分析預(yù)測(cè)表明，CmPDS在104 ~ 123（20）個(gè)氨基酸之間（圖2）有1個(gè)跨膜區(qū)（大于500為有意義的跨膜區(qū)）。在54 ~ 154部位有1個(gè)AIRC（AIR carboxylase）結(jié)構(gòu)域。

利用SOPMA程序?qū)mPDS的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由20.34%的不規(guī)則卷曲、18.92%的延伸鏈、40.28%的α-螺旋和11.46%的β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成。α-螺旋和不規(guī)則卷曲構(gòu)成了該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分。

圖2　CmPDS跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of transmembrane region of CmPDS

2.3CmPDS氨基酸序列比較和進(jìn)化樹分析

利用DNAMan將CmPDS cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中已登錄的其它高等植物的PDS氨基酸序列進(jìn)行同源關(guān)系比較，結(jié)果顯示，參比植物PDS編碼的氨基酸序列存在較高的同源性（圖3）。CmPDS編碼的氨基酸序列與黃瓜、南瓜、苦瓜、草莓、番木瓜、柿、葡萄、番茄和擬南芥PDS編碼的氨基酸同源性分別為92.6%、88.6%、87.8%、77.9%、77.1%、77.3%、76.8%、74.6%和76.6%。

利用BioEdit和MEGA4軟件，將CmPDS cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中已登錄的22種高等植物的PDS氨基酸序列構(gòu)建（bootstrap）neighbor joining（NJ）樹。結(jié)果顯示，CmPDS編碼的氨基酸序列先與黃瓜歸為一類，說明在參比的22種植物中，甜瓜和黃瓜的親緣關(guān)系最近，其次是南瓜和苦瓜，而與水稻、文心蘭等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

圖3　不同植物PDS氨基酸序列同源性比較Fig.3 Alignment of predicted amino acid sequence of PDS from different plant

圖4　不同植物PDS氨基酸序列進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic trees of the deduced amino acid sequences of plant PDS by MEGA5

2.4CmPDS在甜瓜不同器官和果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

用熒光定量方法對(duì)CmPDS表達(dá)模式進(jìn)行了研究。結(jié)果表明CmPDS在甜瓜根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，在葉片中表達(dá)量最高，根中表達(dá)量最低（圖5）；在果實(shí)發(fā)過程中，以授粉后25 d的果實(shí)CmPDS表達(dá)量為最高，接近自然成熟時(shí)，表達(dá)量降低（圖6）。

圖5　甜瓜不同器官CmPDS表達(dá)量Fig.5 Expression of CmPDS in different organs

圖6　不同發(fā)育時(shí)期甜瓜果實(shí)CmPDS表達(dá)量Fig.6 Expression of CmPDS in different stages of fruit development

3　討論

在高等植物中，類胡蘿卜素是在質(zhì)體中通過類異戊二烯途徑合成的[15]。近年來，對(duì)類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵限速反應(yīng)研究較多，同時(shí)對(duì)相關(guān)編碼酶的基因做了較多研究，其中包括：牻兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（GGPS）、八氫番茄紅素合成酶（PSY），八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、ζ–胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）[16]。PDS是類胡蘿卜素合成途徑中的重要限速酶，催化八氫番茄紅素兩步脫氫生成ζ–胡蘿卜素，ζ–胡蘿卜素再經(jīng)ZDS催化進(jìn)一步脫氫生成番茄紅素[17]。本試驗(yàn)成功克隆了甜瓜CmPDS全長(zhǎng)，該cDNA全長(zhǎng)1906 bp，具有完整的開放閱讀框（第126 ~ 1856個(gè)bp），共1731 bp，編碼576個(gè)氨基酸。該序列完整的開放閱讀框推導(dǎo)的氨基酸序列與黃瓜、南瓜、苦瓜、草莓、番木瓜、柿、葡萄、番茄和擬南芥PDS編碼的氨基酸同源性分別為92.6%、88.6%、87.8%、77.9%、77.1%、77.3%、76.8%、74.6%和76.6%。經(jīng)氨基酸疏水性分析發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)克隆的CmPDS所推導(dǎo)的氨基酸序列有一個(gè)顯著的長(zhǎng)20個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)，該跨膜區(qū)上游的氨基酸序列保守性比較差，而下游序列與其他植物PDS所編碼的氨基酸序列的同源性較高。

作為代謝的限速酶，PDS在植物胡蘿卜素代謝中起重要作用。以往研究表明，在以類胡蘿卜素為主要色素的植物中，PDS表達(dá)隨果實(shí)的發(fā)育成熟而上調(diào)[11]。本試驗(yàn)研究表明甜瓜CmPDS在果實(shí)發(fā)育成熟過程中也表現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，但在完全成熟時(shí)表達(dá)量降低，可能因?yàn)楣麑?shí)接近自然成熟時(shí)類胡蘿卜素的分解代謝增強(qiáng)。類胡蘿卜素能作為脫落酸和獨(dú)腳金內(nèi)酯的合成底物被代謝掉，也能被類胡蘿卜素裂解雙加氧酶催化分解，生成多種與果實(shí)香氣相關(guān)的物質(zhì)[18]，而且CmPDS表達(dá)量的這種變化趨勢(shì)和已報(bào)道的該甜瓜品種類胡蘿卜素含量變化趨勢(shì)相符合[14]。有研究證明，PDS表達(dá)受色素含量的調(diào)控，白色組織的PDS mRNA含量要遠(yuǎn)高于綠色組織[19]，但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CmPDS在綠色組織葉片中的表達(dá)量最高，可能原因是葉片中光合作用強(qiáng)，類胡蘿卜素代謝旺盛。類胡蘿卜素既能吸收可見光做為碳同化的能源，又能通過葉黃素循環(huán)耗散掉過剩的能量。也有研究證實(shí)PDS受到沉默時(shí)，植物葉片會(huì)發(fā)生白化現(xiàn)象，色素含量改變，光合作用受阻[20-26]，這與本試驗(yàn)中CmPDS在葉片中的表達(dá)量最高的結(jié)果相符合。

本研究結(jié)果表明，CmPDS在葉片光合作用和果實(shí)類胡蘿卜素積累中起重要作用，在此基礎(chǔ)上可望分離CmPDS果實(shí)特異性啟動(dòng)子并轉(zhuǎn)化甜瓜，為CmPDS在甜瓜品質(zhì)育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression of Phytoene Desaturase Gene (CmPDS) from Fruit of Muskmelon

ZHAO Jun-lin, CONG Hong-zi, SU Chang-yue, YU Xi-yan, WANG Xiu-feng*
College of Horticulture Science and Engineering/Shandong Agricultural University, State Key Laboratory of Crop Biology, Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops(Huanghuai Region), Ministry of Agriculture, Tai’an 271018, China

Abstract:A full-length cDNA encoding Phytoene desaturase(PDS), named as CmPDS (GenBank: KC507802), was isolated from the fruit of‘M01-3’of Muskmelon(Cucumis melo L.) by RT-PCR and RACE. The cDNA has an open reading frame of 1731 bp and encodes a polypeptide of 576 amino acids. Sequence analysis showed that deduced CmPDS protein was highly homologous to other PDS proteins from different species, especially with Cucurbita moschata, Momordica charantia and Ricinus communis, that the identity of amino acid sequence was up to 92.6% ~ 87.8%. Real time PCR analysis indicated that CmPDS expressed in different organs. The transcription levels of CmPDS in leaves and fruit of 25 d after pollination were higher than that in stems, roots and tubers respectively. With the development of fruit, the expression of the gene rised but reduced in the end.

Keywords:Cucumis melo L.; PDS gene; cloning; expression

*通訊作者:Author for correspondence. E-mail:xfwang@sdau.edu.cn

作者簡(jiǎn)介:趙軍林(1989-),男,碩士研究生,研究方向?yàn)槭卟藢W(xué). E-mail:zhaojlin2012@163.com

基金項(xiàng)目:現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資助(CARS-25)

收稿日期:2013-09-06修回日期: 2013-09-20

中圖法分類號(hào):S652

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-2324(2015)04-0481-06