孫婷玉

(南京林業(yè)大學，南京，210037)

葉建仁 吳小芹 朱麗華 吳靜 梁芬

(南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心) (江蘇省有害生物入侵預防與控制重點實驗室(南京林業(yè)大學)) (南京林業(yè)大學)

責任編輯:程 紅。

黑松(Pinus thunbergii)原產(chǎn)日本，為海岸綠化樹種之一，在我國遼東半島、山東、江蘇、浙江和臺灣均有栽培，但由于其高度感染松材線蟲病(Bursaphelenchus xylophilus)使得受害十分嚴重［1］。因此，培育出具有抗松材線蟲病的黑松苗木對解決該問題具有重要意義。組織培養(yǎng)技術可以不受季節(jié)和地域的限制，快速高效地繁殖基因優(yōu)良的樹種。組織培養(yǎng)技術可分為器官發(fā)生和體細胞胚胎發(fā)生。目前國際上普遍認為體細胞胚胎發(fā)生是針葉樹良種基因型規(guī)模化擴繁的最佳途徑［2］。體細胞胚胎發(fā)生具有繁殖速度快、數(shù)量多、結構完整、植株再生率高等特點［3］，對優(yōu)良基因型具有無限擴繁的潛力。體細胞胚胎發(fā)生體系中需要經(jīng)過胚性愈傷組織的誘導、胚性愈傷組織的增殖、體細胞胚的成熟和萌發(fā)等階段，其中胚性愈傷組織的誘導是其關鍵環(huán)節(jié)［4］。自Hakman et al.［5］首次報道由歐洲云杉(Picea abies)未成熟合子胚培養(yǎng)物中獲得體細胞胚并再生出植株以來，針葉樹的體細胞胚胎發(fā)生研究已不斷取得令人矚目的進展。我國針葉樹體細胞胚胎發(fā)生研究開展雖然相對較晚，但是也取得了很大的進展。黃健秋等［6-7］利用馬尾松(Pinus massoniana)、云南松(P.yunnanensis)成熟合子胚誘導體細胞胚胎發(fā)生獲得體細胞胚;唐巍等［8-9］分別利用火炬松(P.taeda)、濕地松(P.elliottii)成熟合子胚通過體細胞胚胎發(fā)生途徑實現(xiàn)植株再生;申曉輝等［10］用紅松(P.koraiensis)未成熟合子胚首次建立了紅松體細胞胚胎培養(yǎng)體系;李清清［11］等用黑松未成熟合子胚建立了黑松體細胞胚胎培養(yǎng)體系;吳靜等［12］首次在國內(nèi)誘導出了抗松材線蟲病赤松(P.densiflora)的胚性愈傷組織。而目前，國內(nèi)尚無有關抗松材線蟲病黑松體細胞胚胎發(fā)生的相關報道。本研究以抗松材線蟲病黑松未成熟合子胚為外植體，對抗性黑松胚性愈傷組織誘導進行了研究，以期提高抗性黑松胚性愈傷組織的誘導率;為抗性黑松體細胞胚胎發(fā)生提供研究材料，以獲得抗性黑松苗木;這對解決我國松材線蟲病具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 外植體材料的獲取

2004年本課題組從日本引進了抗松材線蟲病黑松種子［13］，并在句容林場建立了基因庫種子園?？剐院谒晌闯墒烨蚬勺曰驇旆N子園，選取抗性較強的30、31、34、35、36、37、39 號家系生長健壯的樹木為母樹，于2012—2013年6月底到8月初每周采集1 次，采集后于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 外植體的處理方法

將抗性黑松未成熟球果(圖1a)的珠鱗剝離后取出種子(圖1b)，放入廣口瓶中用無菌水洗滌干凈，轉(zhuǎn)入滅菌的小三角瓶中，在超凈工作臺上用無菌紗布包好，75%乙醇進行表面消毒30 s，再用0.1%HgCl2滅菌30 s～3 min，無菌水沖洗3 次后再用無菌濾紙吸去種子表面多余的水分，最后用鑷子剝?nèi)シN殼和內(nèi)種皮，取雌配子體水平放置于誘導培養(yǎng)基上，每誘導培養(yǎng)基接種3～5 個雌配子體，用封口膜封住培養(yǎng)皿。對于那些還不能剝掉內(nèi)種皮的幼嫩種子，則連同內(nèi)種皮一起接種。

1.3 球果采集時期對胚性愈傷組織誘導的影響

將各采集時期的雌配子體放入設計好的誘導培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基接種3～5 個雌配子體，3 個月后統(tǒng)計胚性、非胚性愈傷組織誘導率。

1.4 球果冷藏時間對胚性愈傷組織誘導的影響

采集的抗性黑松球果，分別在冰箱中4 ℃冷藏7、14、21 d，分3 批次接種于誘導培養(yǎng)基上，3 個月后統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導率以及種子的褐化情況。

1.5 碳源對愈傷組織誘導的影響

將采集的黑松36#家系種子滅菌后接種于分別添加30 g·L-1麥芽糖、蔗糖、葡萄糖的誘導培養(yǎng)基上。每個處理接種雌配子體3～4 個，重復3 次。暗培養(yǎng)，3 個月左右統(tǒng)計胚性和非胚性愈傷組織誘導率。

1.6 不同激素對胚性愈傷組織的誘導的影響

抗性黑松誘導培養(yǎng)基以DCR 為基本培養(yǎng)基［14］，添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1.0～4.0 mg·L-1，6-芐氨基嘌呤(6-BA)0～5.0 mg·L-1，6-呋喃甲基腺嘌呤(KT)0～1.0 mg·L-1。每個處理接種雌配子體3～4 個，重復3 次。暗培養(yǎng)，3 個月左右統(tǒng)計胚性和非胚性愈傷組織誘導率。

1.7 培養(yǎng)條件和數(shù)據(jù)處理

培養(yǎng)溫度(23±1)℃，暗培養(yǎng)。胚性愈傷組織誘導率=(產(chǎn)生胚性愈傷組織雌配子體數(shù)/接種雌配子體數(shù))×100%;非胚性愈傷組織誘導率=(產(chǎn)生非胚性愈傷組織雌配子體數(shù)/接種雌配子體數(shù))×100%，若無特殊說明，上述所有胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基中均添加30.0 g·L-1麥芽糖，1.0 g·L-1肌醇，450.0 mg·L-1谷氨酰胺(Gln)，500.0 mg·L-1水解酪蛋白(CH)，250.0 mg·L-12-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)，5.2 g·L-1瓊脂粉，高壓滅菌(121 ℃，0.4 MPa)20 min，滅菌前pH 調(diào)至5.8。

2 結果與分析

2.1 抗性黑松球果采集期對胚性愈傷組織誘導的影響

合子胚的發(fā)育階段對成功誘導胚性愈傷組織至關重要，而球果采集期與合子胚發(fā)育階段關系密切。研究發(fā)現(xiàn):6月20日至7月11日采集的抗性黑松未成熟球果種鱗幼嫩無木質(zhì)化現(xiàn)象;雌配子體呈光亮淺白色(圖1c)，合子胚從雌配子體中抽出多呈透明的絲狀物。6月20日采集的抗性黑松未成熟球果，胚性愈傷組織的誘導率最高(7.8%)。7月11日采集的抗性黑松未成熟球果，胚性愈傷組織的平均誘導率較高(1.5%)。7月18日采集的抗性黑松球果開始出現(xiàn)木質(zhì)化現(xiàn)象，球果顏色逐漸變淡，從深綠轉(zhuǎn)變成黃綠，雌配子顏色呈乳白色，外種皮薄、黃褐色，至此階段平均誘導率(0.4%)開始下降;8月2日胚性愈傷組織的誘導率為0。胚性愈傷組織的誘導率與球果采集期呈現(xiàn)一定的相關性，即隨著合子胚發(fā)育逐漸成熟，胚性愈傷組織的誘導率逐漸下降。

2.2 抗性黑松球果冷藏時間對胚性愈傷組織誘導的影響

抗性黑松未成熟球果冷藏時間直接影響雌配子體的質(zhì)量。由表1可見:未成熟球果冷藏7～14 d，胚性愈傷組織的誘導率呈上升趨勢。冷藏時間超過14 d，胚性和非愈傷組織的誘導率下降，并且雌配子體的褐化程度顯著上升。抗性黑松球果冷藏7～14 d 誘導出的胚性愈傷組織半透明具黏性(圖1d，e，g)，在誘導培養(yǎng)基上生長速度較快。冷藏14～21 d，雌配子體逐漸變軟顏色發(fā)黃，表面無光澤，胚性愈傷組織的誘導率為0。

表1 冷藏時間對抗性黑松胚性愈傷組織誘導的影響

2.3 碳源對抗性黑松胚性愈傷組織誘導的影響

糖類作為抗性黑松胚性愈傷組織誘導的碳源，其種類對胚性愈傷組織的發(fā)生會產(chǎn)生不同的影響(表2)，在麥芽糖和蔗糖為碳源的誘導培養(yǎng)基上都能產(chǎn)生非胚性愈傷組織，但只有在麥芽糖的誘導培養(yǎng)基上獲得抗性黑松胚性愈傷組織。而以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上不能誘導胚性和非胚性愈傷組織的發(fā)生，可見麥芽糖更適合作為抗性黑松體胚發(fā)生的碳源。

表2 不同碳源對抗性黑松愈傷組織誘導的影響

2.4 植物激素對抗性黑松胚性愈傷組織誘導的影響

植物激素在誘導胚性愈傷組織的過程中至關重要，不同的激素配比與組合對胚性愈傷組織的發(fā)生產(chǎn)生不同的作用(表3)。2，4-D 質(zhì)量濃度1 mg·L-1，當2，4-D 與KT 質(zhì)量濃度比為2 ∶1 時，抗性黑松胚性愈傷組織的誘導率要明顯高于5 ∶1 配比;2，4-D 質(zhì)量濃度4 mg·L-1，當2，4-D 與KT 質(zhì)量濃度比為4 ∶1 和2，4-D 與6-BA 質(zhì)量濃度2 ∶1 時，分別獲得誘導率的最高值(7.5%);保持KT 質(zhì)量濃度0.5 mg·L-1，增加2，4-D 質(zhì)量濃度，抗性黑松胚性愈傷組織的誘導率降低，說明低質(zhì)量濃度的2，4-D更適合抗性黑松胚性愈傷組織的誘導;保持2，4-D質(zhì)量濃度4 mg·L-1，KT 質(zhì)量濃度變化對抗性黑松胚性愈傷組織誘導影響顯著，而6-BA 質(zhì)量濃度變化對抗性黑松胚性愈傷組織誘導影響不顯著，需和2，4-D 配合使用才能更好地發(fā)揮作用。誘導抗性黑松胚性愈傷組織最佳激素組合與配比:2，4-D 4 mg·L-1+6-BA 2 mg·L-1或2，4-D 4 mg·L-1+KT 1 mg·L-1。

表3 不同激素配比對抗性黑松愈傷組織誘導的影響

圖1 抗性黑松未成熟合子胚胚性愈傷組織誘導

3 結論與討論

植物胚性愈傷組織的誘導是一個復雜的過程，一般來說，合子胚比植物幼嫩組織容易誘導胚性愈傷組織，且未成熟合子胚比成熟合子胚容易誘導胚性愈傷組織。針葉樹胚性愈傷組織的誘導一般以未成熟合子胚為外植體［15］。影響胚性愈傷組織誘導的因素包括:外植體的年齡和生理狀態(tài)、基因型、基本培養(yǎng)基、碳源、溫度、植物激素的種類和濃度等［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，抗性黑松未成熟球果采集期、球果冷藏時間、植物激素配比與組合以及所選擇的碳源都對胚性愈傷組織的誘導具有重要的影響。

在松屬樹種中，只有處于某一個發(fā)育階段(窗口期)的幼胚才對胚性愈傷組織的誘導反應敏感［17］。比較北美喬松(P.strobus)［18］、海岸松(P.pinaster)、歐洲赤松(P.sylvestris)［2］等幼胚誘導胚性愈傷組織的球果采種期，發(fā)現(xiàn)處于6月下旬至7月上旬的幼胚為以上松屬樹種誘導胚性愈傷組織的敏感期。本研究發(fā)現(xiàn)，在南京地區(qū)，6月20日至7月11日為誘導抗性黑松胚性愈傷組織的較佳時期，這一結論與以上松屬樹種誘導胚性愈傷組織的最佳采種期基本一致。

Pullman et al.［19］研究發(fā)現(xiàn)外植體接種前進行冷處理(2～4 ℃)1 周以上，能夠有效提高胚性愈傷組織誘導率。吳麗君［20］研究認為球果放在冰箱4 ℃冷藏20 d 內(nèi)有利于濕地松胚性愈傷組織誘導，Haggman et al.［21］在研究紅松體胚發(fā)生中有相似的報道。本研究發(fā)現(xiàn)，抗性黑松球果冷藏7～14 d 能有效提高胚性愈傷組織的誘導率，冷藏超過14 d 胚性愈傷組織的誘導率下降，這與以上結論基本相符。

目前，針葉樹誘導胚性愈傷組織發(fā)生常用的碳源有蔗糖和麥芽糖。楊模華等［22］利用蔗糖誘導出了馬尾松胚性愈傷組織;馬麗源等［23］利用蔗糖誘導出了油松(P.tabuliformis)胚性愈傷組織;Maruyama et al.［24］利用蔗糖、李清清等［11］利用麥芽糖誘導出黑松未成熟合子胚胚性愈傷組織并能發(fā)育成完整的體胚苗。本研究選用麥芽糖、蔗糖和葡萄糖為碳源，但只有在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上誘導出了胚性愈傷組織，說明麥芽糖更適合抗性黑松胚性愈傷組織的誘導。

體胚誘導過程中適當?shù)募に嘏浔葘φT導的影響也很關鍵［25］。韓登媛等［26］在研究華北落葉松(P.larix)胚性愈傷組織誘導中發(fā)現(xiàn)2，4-D 是主要影響因子，其次是KT，最后是6-BA，并且2，4-D 不能單獨使用，需要與KT，6-BA 合理配合才能使胚性愈傷組織的誘導率提高。本研究表明，不同的激素配比與組合對抗性黑松胚性愈傷組織的誘導作用不同。低質(zhì)量濃度的2，4-D 更適合抗性黑松胚性愈傷組織的誘導，KT 質(zhì)量濃度變化對抗性黑松胚性愈傷組織誘導影響比6-BA 明顯，本試驗得出誘導抗性黑松胚性愈傷組織最佳激素組合為2，4-D 4 mg·L-1+6-BA 2 mg·L-1或2，4-D 4 mg·L-1+KT 1 mg·L-1。

黑松體細胞胚胎發(fā)生在國內(nèi)外有少量報道，而且胚性愈傷組織誘導率均較低。Maruyama et al.［24］以日本黑松未成熟合子胚為外植體建立了體細胞胚胎發(fā)生體系，胚性愈傷組織誘導率為2%，國內(nèi)李清清等［11］以黑松未成熟合子胚為外植體，胚性愈傷組織誘導率為1.67%。本研究以日本抗松材線蟲病黑松未成熟合子胚為材料，胚性愈傷組織的誘導率最高為7.8%，可為抗性黑松體胚發(fā)生提供基礎材料。

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