薛煜 甕岳太 季秀 張琳 劉洋 叢贏

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040) (森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學))

責任編輯:程 紅。

樟子松瘤銹病是一種由松櫟柱銹菌(Cronartium guercuum)引起的枝干病害，在東北不同地區(qū)都有大面積發(fā)生［1］。松櫟柱銹菌是一種轉(zhuǎn)主寄生菌，性孢子、春孢子階段生長在樟子松(Pinus sylvestris var.mongolica)上，夏孢子、冬孢子階段生長在蒙古櫟(Quercus mongolica)葉片上。以往的病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)不同林分樟子松瘤銹病的春孢子器成熟期不同，春孢子器的成熟期是否與轉(zhuǎn)主寄主的存在與否及轉(zhuǎn)主寄主葉中某些揮發(fā)性物質(zhì)有關?這是本課題組關注的重點。

乙烯是一種調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育和衰老的內(nèi)源性激素，它既促進營養(yǎng)器官的生長，又能影響開花結(jié)實。從1864年發(fā)現(xiàn)路燈旁邊的樹木提前落葉的現(xiàn)象開始，人們就關注了乙烯的作用。1901年，俄國植物生理學家Neljubow 認為照明氣中的乙烯會引起黑暗中生長的豌豆苗產(chǎn)生“三重反應”，認為乙烯是一種生長調(diào)節(jié)劑［2］。此后科學家們一直在探索植物體內(nèi)的乙烯合成與調(diào)節(jié)機制。Gane 在試驗中發(fā)現(xiàn)面包酵母可以釋放出一種使豌豆苗的生長受到抑制的氣體，這是最早發(fā)現(xiàn)真菌合成乙烯現(xiàn)象［3］，此后陸續(xù)有研究者發(fā)現(xiàn)微生物也具有合成乙烯的能力，如異養(yǎng)細菌Escherichia colli，菌根真菌Cenococcum geophilum、Hebeloma crustuliniforme，植物病原真菌Botrytis cinerea、Fusarium oxysporum［4-7］。Kitajima et al.［8］認為當植物在受到各種不良環(huán)境脅迫(寒冷、高溫、干旱、淹水、鹽漬等)時會大量產(chǎn)生乙烯，這是為了減輕或抵御脅迫而做出的反應。乙烯作為啟動植物防衛(wèi)反應的信號，可以誘導植物體內(nèi)一些病原相關蛋白的產(chǎn)生［8］。為此，本研究測定不同發(fā)育時期蒙古櫟葉中的乙烯質(zhì)量摩爾濃度，并進行了松櫟柱銹菌春孢子萌發(fā)試驗，以探究松瘤銹病春孢子器成熟與蒙古櫟葉子揮發(fā)的乙烯質(zhì)量摩爾濃度間的關系，為今后深入研究乙烯在寄主與病原菌互作中所扮演的角色及其機制奠定基礎，并為掌握該病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律、最佳防治時期提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

銹孢子器成熟度的分級及樣品的采集:2014年5月上旬，在大興安嶺塔河林業(yè)局立地條件相同的樟子松林內(nèi)，分別在撫育伐和未撫育伐的林分，各調(diào)查30 株罹患樟子松瘤銹病病株，檢查春孢子器成熟程度。摘取剛展葉5、10、15、30、45、60 d 的蒙古櫟葉片放入冰盒中封口的容器內(nèi)，帶回室內(nèi)待測。

春孢子器成熟標準:Ⅰ級，未形成春孢子器原基;Ⅱ級，春孢子器包被已形成;Ⅲ級，露出黃色成熟的粉狀物——春孢子。

試劑:HgCl2-HClO4混合液的配制，200 mL HClO4和27.15 g HgCl2加水定容至1 L。2 mol·L-1的HCl 溶液，37% HCl 稀釋6 倍。飽和NaCl 溶液，將NaCl 溶于100 mL 水中至不再溶解為止。

1.2 方法

1.2.1 春孢子萌發(fā)試驗

分別稱取20 g 蒙古櫟10 天生、5 天生葉片，搗碎，混合到2%瓊脂培養(yǎng)基中，制成10 天生、5 天生葉汁培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基切成2 cm×2 cm 的小塊置于載玻片上。將載玻片擱置在滅菌的培養(yǎng)皿中的玻棒上。培養(yǎng)皿中分別鋪好一層用蒸餾水潤濕的脫脂棉，用無菌毛刷粘取新鮮春孢子輕輕彈落在載玻片上，置室溫下培養(yǎng)12 h，以后每隔3 h 觀察1 次，每次選取3 個視野，統(tǒng)計萌發(fā)率。不加葉汁的2%瓊脂培養(yǎng)基為對照。每個處理3 個重復。

1.2.2 蒙古櫟葉片乙烯質(zhì)量摩爾濃度的測定

標準乙烯氣樣的采集:取300 mL HgCl2-HClO4混合液于標定容積的輸液瓶中(590 mL)，加橡皮瓶塞密封。取1 mL 乙烯(99.9%)注入輸液瓶中，振蕩2 h，室溫放置24 h。從輸液瓶中抽取1 mL 氣樣，測定未被吸收的乙烯量。1 mL 乙烯減去未被吸收的乙烯，即為乙烯吸收量。稀釋已吸收乙烯的HgCl2-HClO4混合液1、10、100、500、1 000 倍，用于測定乙烯釋放量。

標準乙烯和蒙古櫟葉中乙烯的測定:取1 mL 已吸收標準乙烯的HgCl2-HClO4混合液于標定容積的Waters 液譜樣品瓶內(nèi)，加2 mol·L-1HCl 1 mL，迅速擰緊瓶蓋，在混合器上振動5 s，置樣品于不同的反應條件，取出樣品瓶，用注射器從橡膠蓋處向樣品瓶中注入2 mL 飽和NaCl 溶液，同時另一注射器抽取2 mL 氣樣，待測。

取蒙古櫟葉5 g，迅速投入裝有12 mL HgCl2-HClO4混合液的試管中，使蒙古櫟葉完全浸沒于反應液中，20 h 后轉(zhuǎn)入研缽中研磨，于12 000 r·min-1離心10 min。取上清液2 mL 于Waters 液譜樣品瓶中。加2 mol·L-1HCl 1 mL，迅速擰緊瓶蓋，在混合器上振動5 s，放入30 ℃水浴保溫5 h。取出樣品瓶，用注射器從橡膠蓋處向樣品瓶中注入2 mL 飽和Nacl 溶液，同時另一注射器抽取2 mL 氣樣，待測。

待測樣品的乙烯質(zhì)量摩爾濃度用島津-mini 3型氣相色譜儀測定，色譜柱4 mm×2 000 mm，G.D.X.502，載氣為氮氣，氫火焰離子檢測器，柱溫70 ℃。每個測定3 個重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同林分中松櫟柱銹菌春孢子器形成情況

從表1可以看出，5月中旬，在經(jīng)過撫育伐的樟子松林內(nèi)，其病株上的春孢子器均未成熟，絕大多數(shù)剛剛形成春孢子器原包被。而在未經(jīng)過撫育伐的樟子松林內(nèi)，林下蒙古櫟已開始展葉，除2 株沒有形成春孢子器外，其他28 株病株均已形成春孢子器，揭開樹皮，可見黃色的春孢子粉。

表1 不同林分松櫟柱銹菌春孢子成熟度調(diào)查(n=30 株)

2.2 蒙古櫟葉汁對春孢子萌發(fā)的影響

春孢子在加蒙古櫟葉汁的2%瓊脂培養(yǎng)基中萌發(fā)率明顯高于未加蒙古櫟葉汁的;而在較老(10 天生)的蒙古櫟葉汁(乙烯質(zhì)量摩爾濃度193.596 nmol·g-1)的培養(yǎng)基上的萌發(fā)率又高于較嫩(5 天生)的蒙古櫟葉汁(乙烯質(zhì)量摩爾濃度993.168 nmol·g-1)的培養(yǎng)基，其萌發(fā)率最高可達84.07%;在未加蒙古櫟葉汁的培養(yǎng)基上萌發(fā)率最低，最高只達56.06%(表2，圖1)。

表2 松櫟柱銹菌春孢子在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)率 %

圖1 春孢子在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)狀

2.3 蒙古櫟不同發(fā)育期乙烯質(zhì)量摩爾濃度

乙烯標準品和蒙古櫟葉樣品的氣相色譜圖見圖2。通過數(shù)據(jù)處理求得在第4 分鐘時的峰值為乙烯峰值，展葉5 d 和展葉10 d 的樣品乙烯質(zhì)量摩爾濃度分別為993.168、193.596 nmol·g-1，其他組的峰值逐漸變小，以至趨于恒定(圖3)。由此可以說明，蒙古櫟葉從萌芽開始，隨著葉子的生長發(fā)育，乙烯的質(zhì)量摩爾濃度不斷降低，并趨于一個穩(wěn)定的值。結(jié)合松櫟柱銹菌春孢子萌發(fā)情況，可證實蒙古櫟葉汁明顯促進了松櫟柱銹菌春孢子的萌發(fā)，且10 天生葉比5 天生葉促進萌發(fā)的效果更佳。這也意味著松櫟柱銹菌在10 天生的櫟葉上侵染機會最多，這時櫟葉的被動抗性結(jié)構(gòu)還未健全，乙烯質(zhì)量摩爾濃度又恰好適于春孢子萌發(fā)定植。

圖2 乙烯標準品(a)和蒙古櫟葉樣品(b)的氣相色譜圖

圖3 不同展葉天數(shù)的蒙古櫟葉樣品的氣相色譜圖

3 結(jié)論與討論

Cronartium guercuum 是一種比較古老的銹菌，在病原菌與寄主長期的協(xié)同進化中，已有了某種默契。蒙古櫟在展葉時，正是松櫟柱銹菌成熟時，它為了保護自身的安全，增強防御病原菌和其他生物的侵襲，而生產(chǎn)大量乙烯，但也可能正是其發(fā)散出的大量乙烯，又給Cronartium guercuum 傳導了有了新“獵物”的信息，從而促進了春孢子器的成熟。Cristeseu et al.［6］等已證實植物受到病原微生物侵染后會在體內(nèi)積累大量的乙烯，這說明寄主和病原菌之間是有感應的。Baldwin 和Schultz［9］在研究中也發(fā)現(xiàn)植物在受到外界傷害后往往會釋放大量的植物揮發(fā)性有機化合物，而其周圍的健康植物能夠感受到這種信息，并積極地表達抗性基因和產(chǎn)生防御物質(zhì)，鄰近健康植物的乙烯信號途徑在植物-植物交流過程中是不可或缺的，茉莉酸信號起到了輔助和信號放大的作用。于延文等［10］也認為在植物的抗病反應中，乙烯是植物防衛(wèi)反應的報警信號物質(zhì)并參與防衛(wèi)反應。張晟瑜［11］在研究中發(fā)現(xiàn)，乙烯對灰霉菌的孢子萌發(fā)無顯著影響，但是對灰霉菌的菌絲生長有顯著促進作用。1～1 000 mg·kg-1的外源乙烯都不同程度地促進了灰霉菌菌絲的伸長，其中1 mg·kg-1處理8 h 后，Bot 0023 和Bot 0024 菌株的發(fā)芽管伸長速度分別是對照組的11.451、15.098 倍。寄主葡萄的營養(yǎng)可誘導灰霉菌合成乙烯，1～50 mg·kg-1的乙烯可顯著(p＜0.05)促進灰霉菌菌絲的生長、增強其對果實的致病性［10］。

經(jīng)過撫育伐的樟子松林，林下無蒙古櫟，松櫟柱銹菌的春孢子器形成的時間要比未經(jīng)過撫育伐的樟子松林晚一周左右。在未經(jīng)撫育伐的樟子松林中，蒙古櫟叢生，也許是蒙古櫟為保護自已而散發(fā)的乙烯反而催熟了松櫟柱銹菌的春孢子器，使其提早成熟。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，春孢子器并不是每年全部發(fā)生，在撫育伐的樟子松林中，都發(fā)現(xiàn)有未形成春孢子器的病株。這是否和性孢子器當年的受精情況和春孢子器在發(fā)育過程中受到某種外界干擾而停止發(fā)育有關，還是春孢子器形成也有某些年份間歇的特性，這些尚未被人們所認識，其原因還有待今后繼續(xù)長期定點定株觀察和深入研究。

松櫟柱銹菌在加入蒙古櫟葉汁的2%瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)好，而較老葉(10 天生)比較嫩葉(5 天生)更好，在未加蒙古櫟葉汁的2%瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)率最低，比較老葉低33.3%，比較嫩葉低22.6%。乙烯對春孢子萌發(fā)有明顯地促進作用，而且還和乙烯的質(zhì)量摩爾濃度有關。乙烯質(zhì)量摩爾濃度在193.596 nmol·g-1(展葉10 d)好于993.168 nmol·g-1(展葉5 d)，這充分證實乙烯在春孢子萌發(fā)中具有催熟的重要的生理和生態(tài)學意義。乙烯還可促進許多植物種子，如谷物、油料(花生、油菜)等以及某些雜草的萌發(fā)，還能促進塊莖、鱗莖、球莖以及休眠芽萌發(fā)［12］。

蒙古櫟葉中乙烯質(zhì)量摩爾濃度的峰值在嫩葉(5 天生)時最高，是較老葉(10 天生)的5 倍，隨著葉齡的增加，乙烯質(zhì)量摩爾濃度迅速下降，并趨于恒定。這可能和寄主防御能力的逐漸增強，細胞壁和角質(zhì)層已逐漸增厚，乙烯防御作用相對減弱，這也是寄主的一種自我調(diào)解能力。

致謝:參加本項工作的還有駱荻、劉豪果、王旭彤、馬麗娜同志，在此表示感謝。

［1］ 薛煜.東北林區(qū)銹菌與銹?。跰］.哈爾濱:東北林業(yè)大學出版社，1995.

［2］ Neljubow D N.Uberdie horizontale nutation der stengel von pisum salivun und einiger Anderen pflanzen［J］.Beilh Bol Centralbl，1901，10:128-139.

［3］ Gane R.Production of ethylene by some ripening fruits［J］.Nature，1934，134:1008.

［4］ Ince J E，Knowles C J.Ethylene formation by cell-free extracts of Escherichia coli［J］.Arch Microbiol，1986，146(2):151-158.

［5］ Weingart H，VOlksch B，Ullrich M.Comparison of ethylene production by Pseudomonas syringae and Ralstonia solanacearum［J］.Phyto Pathology，1999，89(5):360-365.

［6］ Cristeseu S M，De Martinis D，Hekkert S L，et al.Ethylene production by Botrytis cinerea in vitro and in tomatoes［J］.Appl Environ Microbiol，2002，68(11):5342-5350.

［7］ Graham J H，Linderman R G.Ethylene production by ectomycorrhizal fungi，F(xiàn)usarium oxysporum f.sp.pini，and by aseptically synthesized ectomycorrhizae and Fusarium-infected Douglas-fir roots［J］.Can J Microbiol，1980，26:1340-1347.

［8］ Kitajima S，Sato F.Plant pathogenesis-related proteins:molecular mechanisms of gene expression and protein function［J］.J Biochem，1999，125(1):1-8.

［9］ Baldwin I T，Schultz J C.Rapid changes in tree leaf chemistry induced by damage:evidence for communication between plants［J］.Science，1983，221:277-279.

［10］ 于延文，黃榮峰.乙烯與植物抗逆性［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導報，2013，15(2):70-75.

［11］ 張晟瑜.乙烯對灰霉菌(Botrytis cinerea)生長發(fā)育及致病性的影響［D］.上海:華東師范大學生命科學學院，2007:30-37.

［12］ 劉愚，焦新之.植物體內(nèi)乙烯的生物學作用及其調(diào)節(jié)控制［J］.植物生理學報，1978，4(2):205-209.