楊麗，趙新蘭，雷丹丹，廖斌，秦愛平

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論著·基礎(chǔ)

破骨細(xì)胞分化中NFATc1/miR-125a作用通路的研究

楊麗，趙新蘭，雷丹丹，廖斌，秦愛平

microRNA;T細(xì)胞核因子1蛋白;腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6;破骨細(xì)胞分化;轉(zhuǎn)錄因子；啟動(dòng)子

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.03.018

1 材料與方法

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2 破骨細(xì)胞分化： 誘導(dǎo)液(25 ng/ml重組人類巨噬細(xì)胞集落刺激因子+30 ng/ml RANKL)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。酒石酸酸性磷酸酶染色法鑒定破骨細(xì)胞的成熟，同時(shí)檢測組織蛋白酶免疫染色并檢測破骨細(xì)胞分化標(biāo)志性基因，如RAP和磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子1(NFATc1)的mRNA的表達(dá)水平。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR分析： 利用羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，方法按參考文獻(xiàn)[10]。miR-125a、U6、NFATc1和β-actin的引物見表1、表2， U6和β-actin作為內(nèi)參。1.2.4 miR-125a轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測： 根據(jù)Marson等[11]公布的miRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)數(shù)據(jù)庫得出miR-125a的TSS區(qū)域。選用常用的預(yù)測軟件TF search軟件(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)。

表1 miRNAs實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列

表2 miRNAs實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物序列

注:F： 正向引物; R：反向引物; Acc.No：Genbank公布的準(zhǔn)入號(hào)

在本研究中利用TF search軟件預(yù)測結(jié)合于miR-125a啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。

1.2.6 凝膠遷移電泳實(shí)驗(yàn)(EMSA)： 設(shè)計(jì)包含NFATc1結(jié)合位點(diǎn)的miR-125a啟動(dòng)子序列的雙鏈寡核苷酸探針。野生型：5'-CCCTTTTTTCCAGGATCCAGG-3'(斜體部分為NFATc1結(jié)合位點(diǎn))。地高辛標(biāo)記雙鏈寡核苷酸探針，以1∶10或1∶100無標(biāo)記野生型或突變型寡核苷酸，突變型：5'-CCCTTTcTcaCAGGATCCAGG-3'(斜體小寫位點(diǎn)為突變位點(diǎn))。NFATc1特異性抗體或?qū)φ镇?yàn)證NFATc1的存在。凝膠遷移電泳實(shí)驗(yàn)按照說明書進(jìn)行(RocheAppliedScience)。

1.2.7 染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(CHIP)： 在37°C、4%CO2下將細(xì)胞與1%甲醛交聯(lián)。根據(jù)染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)試劑盒(Upstate,Charlottesville,VA)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。DNA-染色質(zhì)復(fù)合物通過anti-NFATc1(SantaCruzBio-technology,Inc.)進(jìn)行免疫沉淀。無抗體組或?qū)φ战MIgG抗體作為陰性對(duì)照。引物序列如下：引物-A: 正向引物,5'-GTACACCACCCAGTCCCC-3'，反向引物，5'-GGTTTTGAAGGAGTTAGGG-3'; 引物-B:正向引物,5'-GGGGAGGTGGAGGAAGAC-3',反向引物，5'-GGCACTCCAAAGCCAGTC-3';引物-C: 正向引物,5'-GAGGAAAGACATCCGAAAA-3'; 反向引物, 5'-TCTCACCCTTCTCCACCC-3'。

2 結(jié) 果

2.1NFATc1與miR-125a的結(jié)合位點(diǎn) 本研究根據(jù)miRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫得出miR-125a的TSS位于19號(hào)染色體的52194997。本研究檢測了其位點(diǎn)前2kb的堿基序列，然后利用TF-Search預(yù)測軟件預(yù)測到NFATc1可結(jié)合于miR-125a的TSS位點(diǎn)前第1515～1510堿基。其結(jié)合的核心序列為“TTTTCC”。凝膠遷移電泳實(shí)驗(yàn)(EMSA)結(jié)果表明，NFATc1結(jié)合于筆者所預(yù)測的miR-125a啟動(dòng)子靶位點(diǎn)。結(jié)果示未標(biāo)記的野生型探針可劑量依賴性競爭結(jié)合形成復(fù)合物。通過NFATc1抗體驗(yàn)證了復(fù)合物中NFATc1蛋白的存在(圖1)。

注：自左至右依次為1～8泳道。標(biāo)記過的寡核苷酸鏈探針(WT Oligo 1)單獨(dú)孵育(第1泳道),與提取物形成復(fù)合物在第2泳道；加入1∶10或1∶100未標(biāo)記探針(WT Oligo 1)競爭實(shí)驗(yàn)的在第3、4泳道；另外未標(biāo)記的突變型探針(mutant Oligo 1)在第5、6泳道；加了NFATc1抗體(anti-NFATc1)的在第7泳道；而IgG作為對(duì)照陰性抗體的在第8泳道 圖1 EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)NFATc1結(jié)合于miR-125a的啟動(dòng)子區(qū)域

另外本研究進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證NFATc1可以結(jié)合于破骨細(xì)胞內(nèi)生性miR-125a的啟動(dòng)子。交聯(lián)和斷裂過的蛋白—染色質(zhì)復(fù)合物與NFATc1抗體進(jìn)行免疫沉淀?？瞻卓贵w或IgG抗體作為對(duì)照。沉淀的DNA和包含NFATc1結(jié)合位點(diǎn)的miR-125a啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中引物A跨度包含NFATc1在miR-125a啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)，陰性對(duì)照引物B和C分別為距離結(jié)合位點(diǎn)較遠(yuǎn)的5’-端和3’-端。從DNA與NFATc1抗體得到免疫沉淀PCR產(chǎn)物，而DNA與對(duì)照組卻無產(chǎn)物(圖2)。這些結(jié)果表明NFATc1結(jié)合于筆者所推測的miR-125a啟動(dòng)子區(qū)。

注：上圖為CHIP試驗(yàn)中設(shè)計(jì)引物的示意圖。下圖為CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果。自左至右依次為1～7泳道。無抗體組(input; 第1、2和3泳道)；加NFATc1抗體組(第4、5和6泳道)；IgG抗體陰性對(duì)照組(第7泳道)；引物A組(1599/1415， 第1、4和7泳道)；引物B組(1886/1767，第2、5泳道)；引物C組((385/266，第3和6泳道) 圖2 CHIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NFATc1與miR-125a啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合

注：與pcDNA3.1組比較，aP<0.05；與si-C組比較，bP<0.05 圖3 過表達(dá)或下調(diào)NFATc1表達(dá)可升高或抑制miR-125a的表達(dá)

3 討 論

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a在破骨細(xì)胞的分化過程中起到了重要的調(diào)控作用[12，13]，而其通過與TRAF6mRNA的3’UTR結(jié)合來調(diào)控破骨細(xì)胞的分化。于是，我們提出科學(xué)假想：調(diào)控miR-125a表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子必定在破骨細(xì)胞的分化過程中起到重要的調(diào)控作用，那么，調(diào)控該轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)則為骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新的靶點(diǎn)。

在破骨細(xì)胞分化過程中NFATc1和PU.1等一些轉(zhuǎn)錄因子必不可少[14～16]。NFATc1是RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過程中最重要的因子。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NFATc1缺失的前體細(xì)胞不能完成破骨細(xì)胞的分化[17]。RANKL信號(hào)通路缺如時(shí)，異位表達(dá)的NFATc1足以促使骨髓衍生的單核/巨噬細(xì)胞形成TRAP陽性的多核類破骨細(xì)胞[18]。NFATc1基因缺失小鼠表現(xiàn)為破骨細(xì)胞明顯減少導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[19]。綜上，NFATc1是RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過程中的重要調(diào)控因子，控制著破骨細(xì)胞分化最后階段的轉(zhuǎn)錄程序。 本研究預(yù)測的miRNA的啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)文庫預(yù)測了miR-125a的啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)信息，并發(fā)現(xiàn)了其啟動(dòng)子區(qū)域存在可能被NFATc1結(jié)合的序列(TTTTCC)。我們進(jìn)行了EMSA和CHIP實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了NFATc1通過結(jié)合于miR-125a的啟動(dòng)子區(qū)域而抑制了miR-125a的表達(dá)。過表達(dá)NFATc1顯著地降低了miR-125a的表達(dá)，反之則結(jié)果相反。因此，認(rèn)為RANKL通過轉(zhuǎn)錄因子NFATc1抑制miR-125a的表達(dá)來促使破骨細(xì)胞分化。

本研究可以得出miR-125a與其轉(zhuǎn)錄因子NFATc1在破骨細(xì)胞分化過程中的作用模式。NFATc1通過抑制miR-125a的表達(dá)而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化過程。因此，NFATc1/miR-125a調(diào)控通路豐富了miR-125a在破骨細(xì)胞分化過程中的作用機(jī)制研究，為miRNA/蛋白質(zhì)調(diào)控模式研究提供了新的依據(jù)。

綜上所述，本研究證實(shí)miR-125a通過NFATc1/miR-125a調(diào)控通路參與破骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)，并為miRNA在破骨細(xì)胞分化中的作用提供了新的認(rèn)識(shí)，揭示了通過調(diào)控NFATc1的表達(dá)來改變miR-125a的表達(dá),可能成為骨代謝疾病新的治療靶點(diǎn)。

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NFATc1/miR-125a function pathway mediates osteoclastogenesis

YANGLi*,ZHAOXinlan,LEIDandan,LIAOBin,QINAiping.

*DepartmentofGeriatricEndocrinology,HunanProvinceMawangduiHospital,Hunan,Changsha410001,ChinaCorrespondingauthor:QINAiping,E-mail:qinaip@163.com

microRNA; T nuclear factor 1 protein; Tumor necrosis factor receptor associated factor 6; Osteoclast differentiation; Transcription factor; Promoter

湖南省自然科學(xué)基金(No.13JJ4119)； 湖南省保健專項(xiàng)資金(No.A2014-02)

410016 長沙，湖南省馬王堆醫(yī)院老年內(nèi)分泌科(楊麗、趙新蘭、廖斌、秦愛平)； 410010 長沙，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院內(nèi)分泌科(雷丹丹)

秦愛平，E-mail:qinaip@163.com

2014-11-06)