張艷霞，高天旸，李梅清，周長華，陳 哲，全 燕，趙雪峰，李 銳

（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南衡陽421001；2.南華星輝生殖健康專科醫(yī)院生殖中心，湖南衡陽421001；3.廣東省第二人民醫(yī)院生殖中心，廣東廣州518037；4.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南衡陽421001）

反復(fù)自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指連續(xù)兩次及以上的自然流產(chǎn)，發(fā)生率約占總?cè)焉飻?shù)的5%。RSA 的發(fā)病原因復(fù)雜，包括解剖、內(nèi)分泌、染色體異常、感染、環(huán)境理化因素的影響等。其中15%～50%的RSA 找不到原因，稱為不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)（URSA），近代生殖免疫的研究提示多數(shù)系同種免疫異常所致，即類似于同種移植排斥反應(yīng)。研究證實，1型輔助T 淋巴細(xì)胞與2型輔助T 淋巴細(xì)胞的比值（Th1／Th2）平衡向Th1偏移，NK 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞功能異常，樹突狀細(xì)胞功能異常等均可能導(dǎo)致母胎免疫平衡破壞，導(dǎo)致流產(chǎn)［1］。

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是目前已知的功能最強的抗原提呈細(xì)胞（APC），是機體免疫反應(yīng)始動者［2］，參與了調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的誘導(dǎo)分化［3］、NK 細(xì)胞的激活及Th1／Th2之間平衡的調(diào)節(jié)［4］，因此DC 對妊娠的維持具有重要意義。人的DC可分為髓樣DC（myeloid dendritic cell，MDC）亞群和漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid dendritic cell，PDC）亞群。MDC 經(jīng)激活能產(chǎn)生大量IL-12，使Th0分化為Th1細(xì)胞［5-6］，而PDC有利于Th0分化為Th2細(xì)胞［5，7-8］。Th1型細(xì)胞因子具有胚胎毒性作用，而Th2型細(xì)胞因子對正常妊娠的維持起重要作用。妊娠時期的免疫調(diào)節(jié)作用不僅發(fā)生于母體全身免疫系統(tǒng)，而且也發(fā)生在妊娠子宮局部，這種局部免疫因素的調(diào)節(jié)作用更直接地影響著母胎之間的相互作用。也有觀點認(rèn)為胎兒從未與母體組織直接接觸，因此母胎免疫調(diào)控機制可能僅發(fā)生于胎盤的母胎界面處［9］。DC主要分布于皮膚和黏膜等表面組織，在黏膜表面抗原的免疫應(yīng)答的啟動和調(diào)節(jié)過程中起了舉足輕重的作用。蛻膜是一種特殊的黏膜組織，蛻膜DC 被認(rèn)為在維持母胎免疫調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［4，10］。

因此，本研究擬通過檢測URSA 患者與正常計劃外妊娠人流婦女蛻膜組織中DC 亞群的變化，探討DC 亞群在URSA中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 URSA 組：研究對象為2012年5月至2013年5月于廣東省第二人民醫(yī)院婦科、生殖醫(yī)學(xué)科門診就診的妊娠12周內(nèi)、B超提示胚胎停止發(fā)育的URSA 患者22例，年齡19～37歲，平均（28.3±5.2）歲，孕次2～5次。所有患者均在流產(chǎn)前或后進(jìn)行病因篩查，入選者需符合以下條件：（1）女方無生殖道畸形；（2）優(yōu)生4項（TORCH）檢查為陰性；（3）月經(jīng)周期正常；（4）性激素、甲狀腺功能、空腹血糖、胰島素等內(nèi)分泌檢查均正常；（5）抗心磷脂抗體、抗核抗體（ANA）等自身免疫抗體陰性；（6）衣原體、支原體等檢查排除生殖道感染；（7）無血型不合或抗體效價小于1∶128；（8）男方精液常規(guī)檢查正常；（9）夫婦雙方染色體檢查正常，排除家族遺傳病史。對照組選取同期年齡及孕次、孕周相匹配的因計劃外妊娠要求人工流產(chǎn)的正常妊娠婦女20例，年齡21～37歲，平均（28.0±5.5）歲，孕次2～4次。須符合以下條件：（1）無自然流產(chǎn)、死產(chǎn)、死胎等異常孕育史；（2）無解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌等方面的異常；（3）無感染、自身免疫性疾病史，本次妊娠期間無陰道流血、腹痛等先兆流產(chǎn)癥狀和體征；（4）B超檢查顯示胚胎發(fā)育正常。

1.1.2 主要試劑與儀器 LIN1-FITC、FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司。PerCP-Cy5.5 抗人HLA-DR、PE 抗人CD123、APC 抗人CD11c、PerCP-Cy5.5 鼠IgG2bIsotype Control、PE 鼠IgG1、APC 鼠IgG1 均 購 自 美 國eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 無菌方法采集人工流產(chǎn)負(fù)壓吸引蛻膜組織，將收取的蛻膜組織立即置于冰塊預(yù)冷的RPMI1640培養(yǎng)液中，迅速運回實驗室。標(biāo)本采集經(jīng)廣東省第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者本人知情同意。

1.2.2 蛻膜單個核細(xì)胞的分離 新鮮蛻膜組織用無菌PBS漂洗2～3次，剪碎成約1mm3左右的組織塊，置于120目濾網(wǎng)上，用20mL橡皮針?biāo)ㄑ心?。收集通過濾網(wǎng)的細(xì)胞懸液，再過200目濾網(wǎng)。收集通過200 目濾網(wǎng)的細(xì)胞懸液，800r／min離心10min。棄上清，用PBS重懸細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液以1∶1體積平鋪于淋巴細(xì)胞分離液上，4 ℃2 000r／min離心25min。吸出中間的淋巴細(xì)胞層，加入1×PBS緩沖液，800r／min離心10min。棄上清，再加入PBS 重懸細(xì)胞，800r／min 離心10 min。棄上清，加入少量PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)、調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／L，待用。

1.2.3 DC亞群的測定 （1）單克隆抗體標(biāo)記：取Falcon離心管，取100μL上述待用的單個核細(xì)胞，加入抗人LIN1-FITC抗體20μL，PerCP-Cy5.5 抗人HLA-DR 抗體10μL，APC 抗人CD11c抗體5μL，PE抗人CD123抗體5μL，振蕩混勻后室溫避光孵育25min。同時設(shè)置同型對照管。（2）加入PBS漂洗2次，300×g離心5 min，棄上清。（3）輕輕混勻，加入300 μL PBS。（4）2～8 ℃避光保存，24h內(nèi)上機分析。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析 全部數(shù)據(jù)經(jīng)FACS Calibur流式細(xì)胞儀和CELLquest軟件獲取，獲取5×104個細(xì)胞。使用FSC／SSC點圖，畫R1，排除碎片和死細(xì)胞。找到淋巴細(xì)胞系列抗原LIN1弱陽性和陰性群體，使用抗HLA-DR／LIN1 點圖（G1＝R1），畫R2，圈定LIN1弱陽性和陰性及抗HLA-DR 陽性細(xì)胞群，該群細(xì)胞界定為DC。使用CD11c／CD123點圖（G2＝R2）區(qū)分CD123＋及CD11c＋細(xì)胞群分別為PDC及MDC。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，行方差齊性檢驗后，采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

URSA 組蛻膜中DC、MDC、PDC、MDC／PDC 的水平與對照組比較均顯著增高（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 兩組蛻膜樹突狀細(xì)胞亞群比較（±s，n＝20，%）

表1 兩組蛻膜樹突狀細(xì)胞亞群比較（±s，n＝20，%）

項目 對照組 URSA 組t P DC／MNC 1.01±0.10 2.05±0.15 26.90 0.000 MDC／MNC 0.67±0.07 1.43±0.12 24.70 0.000 PDC／MNC 0.06±0.02 0.11±0.02 10.05 0.000 MDC／PDC 11.04±2.81 12.87±1.70 2.58 0.014

圖1 兩組患者蛻膜DC亞群流式細(xì)胞分析圖

3 討 論

DC是目前已知的功能最強的APC，也是體內(nèi)惟一能直接激活初始T 細(xì)胞的APC。不僅可以通過誘導(dǎo)T 細(xì)胞無能及克隆清除、分泌細(xì)胞因子及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的擴增等方式來誘導(dǎo)免疫耐受［11-12］，在某些理化因素、內(nèi)環(huán)境改變及致炎因子的影響下，亦可以激活效應(yīng)T 細(xì)胞，產(chǎn)生免疫應(yīng)答［13］。DC 產(chǎn)生免疫耐受還是免疫應(yīng)答主要取決于其亞群分化、成熟度及其分泌的細(xì)胞因子的模式等。DC 依據(jù)來源不同可分為MDC 和PDC。DC亞群的不同，其功能亦存在差異。MDC 表達(dá)髓系抗原CD11c，與單核巨噬細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞，可分泌IL-12，使Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，介導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，對胚胎具有細(xì)胞毒性；PDC來源于淋巴樣干細(xì)胞，缺乏髓系標(biāo)志物，但可表達(dá)CD123，可分泌IL-4、IL-10，使Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，介導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，有利于妊娠的維持［14］。同時PDC由于具有誘導(dǎo)Th細(xì)胞凋亡的能力而被認(rèn)為具有免疫耐受功能［15］。

母體蛻膜組織和胎盤滋養(yǎng)層組織共同構(gòu)成的母-胎界面是妊娠免疫耐受的基礎(chǔ)。蛻膜是母體與胎兒成分密切接觸的部位，妊娠早期蛻膜含有大量白細(xì)胞，包括蛻膜NK 細(xì)胞、DC、單核巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞等，這些白細(xì)胞之間互相作用形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。Abraham 等［15］于2000年發(fā)現(xiàn)了人類蛻膜DC的存在，并首次對其超微結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了詳細(xì)的描述。另外一些學(xué)者［4，10，16］也證實，人類早期妊娠的蛻膜中存在DC。Blois等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的整個妊娠過程中子宮蛻膜中均有DC存在，進(jìn)而推測DC可能在母胎界面的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。大量文獻(xiàn)表明，蛻膜DC亞群可能在正常妊娠維持母胎免疫調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［4，10］。

目前已有共識，Th1／Th2型細(xì)胞因子的平衡對妊娠的維持起重要作用。而初始Th細(xì)胞（Th0）激活并向Th2 或Th1分化需要APC的參與。DC 廣泛分布于皮膚、消化道、呼吸道黏膜等機體防御第一線，其功能獨特之處在于全身所有APC中惟有DC 才能激活初始型T 細(xì)胞，是識別內(nèi)外抗原，調(diào)節(jié)免疫功能，維持機體穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。在母胎界面，母體保護(hù)胎兒的免疫耐受與防御病原體的免疫反應(yīng)之間的平衡對正常妊娠的維持起關(guān)鍵作用。目前DC 可調(diào)節(jié)免疫耐受及激發(fā)免疫應(yīng)答的雙重功效也被認(rèn)可，Kammerer等［18］對早孕子宮蛻膜中具有DC 形態(tài)特征的細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，早孕蛻膜中存在CD83＋細(xì)胞，而CD83＋被認(rèn)為是DC成熟的標(biāo)志。與外周血一樣，蛻膜CD83＋細(xì)胞富集后能夠進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，說明其也有免疫活性，提示在某些致炎因素的影響下，DC 也可以產(chǎn)生免疫應(yīng)答，進(jìn)而使胚胎被排斥，導(dǎo)致流產(chǎn)。雖然目前關(guān)于樹突狀細(xì)胞與妊娠免疫耐受的研究較多，但大部分都限于正常妊娠，對于流產(chǎn)與DC相關(guān)的研究目前報道較少。

本研究發(fā)現(xiàn)URSA 組與對照組比較，自然流產(chǎn)患者其DC、MDC均較對照組顯著性增高，MDC／PDC 比值明顯增加，而蛻膜中的MDC增加尤為明顯，因此推測在URSA 患者中由于MDC、MDC／PDC的增加，以MDC 亞群占優(yōu)勢，使IL-12等Th1型細(xì)胞因子分泌增加，IL-10 等Th2 型細(xì)胞因子分泌減少，導(dǎo)致Th1／Th2 型細(xì)胞因子的平衡向Th1 型細(xì)胞因子偏移，使胚胎遭到免疫攻擊，導(dǎo)致流產(chǎn)。因此，MDC 和PDC 含量的差異可能導(dǎo)致母體免疫反應(yīng)是傾向于免疫排斥還是免疫耐受。DC亞群的這一變化可能與自然流產(chǎn)有相關(guān)性。

母胎免疫耐受的維持不是由一個或幾個獨立機制所調(diào)控，免疫調(diào)節(jié)是一種精細(xì)、復(fù)雜的現(xiàn)象，是由多細(xì)胞、多種機制共同參與、互相制約、穩(wěn)定協(xié)調(diào)的動態(tài)平衡過程。積極探索DC 在妊娠中的作用機制，對解決器官移植排斥反應(yīng)及免疫性病理妊娠的治療等具有重要意義。

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