陳建中，楊 春，劉春雷，朱房勇，胡 瑜，李 松△

（1.昆明醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，云南昆明650031；2.云南文山州醫(yī)院口腔科，云南文山663000；3.江蘇省無錫市第三人民醫(yī)院口腔科，江蘇無錫214021）

髁突軟骨在生長發(fā)育中受到各種形式應力的作用，這些生物力對髁突軟骨的生長發(fā)育及病理改變起著重要的作用［1-8］。目前關于應力改變在體內(nèi)對髁突軟骨超微結(jié)構影響的研究報道不多，本實驗通過建立年輕大鼠髁突頸部截骨及骨折動物模型，造成體內(nèi)應力改變的程度不同，利用掃描電鏡（SEM）及透射電鏡（TEM）觀察髁突軟骨組織在術后不同時間點的超微結(jié)構變化，進一步探索應力變化對髁突軟骨影響的機制及其生理、病理意義。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 選擇4 周齡雄性SD 大鼠54只（昆明醫(yī)科大學動物試驗中心），體質(zhì)量（149±3）g。鑷子、單面刀片、毛筆、日立SD450型SEM、日立H2600型TEM。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為3 組：截骨組（右側(cè)），骨折組（右側(cè)），空白對照組（右側(cè)）。

1.2.2 髁突頸骨折及截骨的動物模型建立 用1%戊巴比妥鈉行大鼠腹腔注射實施全身麻醉。大鼠右側(cè)耳前1cm 切口，切開皮膚、皮下組織，從顳肌、咬肌及外耳道之間凹陷處進入，鈍性剝離暴露髁突頸部，截骨組用自制血管鉗橫行截除髁突頸部分軟骨，髁突頸骨折組用眼科剪剪斷髁突頸，分層縫合創(chuàng)口。術后2d內(nèi)喂以精細食物，再進行2d精細物與常規(guī)飼料的混合喂養(yǎng)，之后恢復常規(guī)飼料飼養(yǎng)。分別于術后1、3、5周時處死SD 大鼠；分成3部分，分別用蘇木素-伊紅（HE）染色、SEM 及TEM 觀察。于截骨組手術側(cè)（右側(cè)）、骨折組手術側(cè)（右側(cè)）、對照組（右側(cè)）取下髁突軟骨。

1.2.3 HE 染色 4%多聚甲醛固定液固定24h。在20%甲酸中脫鈣（約18h），常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋，制備4μm 厚石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。

1.2.4 SEM 觀察 樣品用0.1mol／L 磷酸緩沖液（pH7.2）沖洗3次，每次15s。4%多聚甲醛4 ℃條件下固定72h。將標本置于30%～100%乙醇逐級脫水，其中30%乙醇1次，每次10min，100%乙醇2 次，每次10 min，純乙酸異戊酯處理，CO2臨界點干燥，離子濺射，日立SD450型SEM 觀察。

1.2.5 TEM 觀察 樣品在2.5%的戊二醛溶液中4 ℃固定過夜，磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15min；10mL／L鋨酸再固定后，脫水，丙酮置換，環(huán)氧樹脂618包埋，切片機切片，日立H2600型TEM 觀察。

2 結(jié) 果

2.1 大體標本觀察 實驗組（截骨組、骨折組）與空白對照組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），實驗中各組大鼠無意外死亡，截骨組術后3周髁突頭呈縮小趨勢，術后5、9周髁突變窄而高，呈現(xiàn)縮小趨勢。骨折組術后3、5、9周，髁突呈縮小趨勢，但縮小程度較截骨組小。

2.2 光鏡結(jié)果 髁突從外至內(nèi)分為纖維層、增殖層、成軟骨細胞層及肥大細胞層。術后3、5周，截骨組及骨折組總厚度均小于空白對照組，術后3周截骨組手術側(cè)更多的形成軟骨下骨組織。見圖1。

2.3 SEM 觀察結(jié)果 空白對照組髁突軟骨表面呈波紋狀結(jié)構，上散布顆粒狀物質(zhì)。隨著鼠齡的增大，顆粒狀物質(zhì)減少，波紋狀結(jié)構紊亂，但表面光滑，凝膠狀物質(zhì)覆蓋完整。骨折組術后1周，髁突軟骨表面波紋狀形態(tài)不明顯，顆粒狀物質(zhì)相比于同齡空白對照組減少。術后3周，表面波紋狀形態(tài)不明顯，少部分區(qū)域凝膠狀物質(zhì)消失，深層膠原纖維暴露。術后5周，顆粒狀物質(zhì)消失，表面波紋狀形態(tài)不明顯，凝膠狀物質(zhì)消失，深層膠原纖維暴露，但未出現(xiàn)纖維斷裂。截骨組術后1周，髁突軟骨表面波紋狀形態(tài)紊亂，顆粒狀物質(zhì)相比于空白對照組減少，凝膠狀物質(zhì)覆蓋完整。術后3周，大部分區(qū)域凝膠狀物質(zhì)消失，多處深層膠原纖維暴露。術后5周，顆粒狀物質(zhì)消失，深層膠原纖維廣泛暴露，并有纖維斷裂、崩解。見圖2。

2.4 TEM 觀察結(jié)果 骨折組術后3周，纖維層可見到裂隙及空泡樣變，膠原纖維斷裂。截骨組術后1周，纖維細胞層排列更為稀疏，表面纖維排列紊亂甚至缺失。術后3周，膠原排列紊亂，軟骨細胞較空白對照組成熟分化更為明顯。術后5周，膠原纖維排列更為紊亂，纖維層中可見到裂隙?？瞻讓φ战M在纖維層未見到裂隙及纖維排列紊亂。見圖3。

圖1 髁突軟骨的光鏡結(jié)果（×100）

圖2 髁突軟骨的SEM 觀察結(jié)果

圖3 髁突軟骨的TEM 觀察結(jié)果

3 討 論

髁突軟骨作為下頜骨重要的生長區(qū)，在髁突與下頜骨的生長發(fā)育中起著非常重要的作用。髁突軟骨與四肢生長板軟骨不同，為纖維軟骨，成骨方式為軟骨內(nèi)成骨。在軟骨生長發(fā)育過程中，關節(jié)軟骨在受到各種類型的應力后，引起軟骨一系列的物理、化學變化，進而引起軟骨細胞的生理活動的變化。

正常的顳頜關節(jié)髁突表面覆蓋有一層厚約2μm 的凝膠樣物質(zhì)，此物質(zhì)來源于關節(jié)滑液，由滑膜B 細胞產(chǎn)生，被認為是關節(jié)健康標志。當滑液的潤滑功能被破壞或軟骨表層膠原纖維暴露時，關節(jié)內(nèi)摩擦系數(shù)將升高［9］，久之將會破壞關節(jié)健康。本實驗通過建立大鼠髁突頸部骨折及截骨的動物模型模擬作用于髁突的異常應力模型，SEM 觀察到髁突骨折及截骨組在術后3周均有膠原纖維暴露，截骨組在術后5周見到膠原纖維斷裂，且兩組均有凝膠樣物質(zhì)的消失。TEM 也觀察到術后3周，骨折組見膠原纖維斷裂，而截骨組術后5周，纖維層中可見到裂隙。在空白對照組中，纖維層未見到裂隙及纖維排列紊亂。SEM 及TEM 均觀察到膠原纖維排列紊亂或斷裂，與國內(nèi)一些學者觀察結(jié)果相似。傅開元等［10］通過建立牙合創(chuàng)傷的動物模型，觀察到創(chuàng)傷組3、5個月組的髁突軟骨均可見明顯的退行性改變，最表面的覆蓋物脫落，膠原纖維排列松散、斷裂。黃洋等［11］建立偏側(cè)咀嚼動物模型，發(fā)現(xiàn)偏側(cè)咀嚼一段時間后髁突表面凝膠狀物質(zhì)不完整，膠原纖維松解、斷裂及暴露。一些學者認為膠原纖維的暴露可能是軟骨變性的開始，而當關節(jié)出現(xiàn)不平衡運動時，纖維可能松解、裂隙甚至斷裂［12］，這與本實驗結(jié)果相符，截骨組手術側(cè)纖維層出現(xiàn)裂隙及膠原斷裂可能與截骨導致應力改變更為明顯有關。此外，膠原纖維松解斷裂，暴露于關節(jié)腔，軟骨內(nèi)蛋白多糖和膠原纖維等大分子進入關節(jié)腔，可能成為抗原而刺激機體引發(fā)局部的免疫反應，使軟骨組織受到破壞。同時，隨著應力的改變，術后3周截骨組手術側(cè)軟骨細胞成熟分化能力較空白對照組增強，更多的軟骨細胞加速鈣化形成骨組織，提示應力變化影響軟骨細胞的成熟分化。Chen等［13］通過髁突軟骨細胞體外培養(yǎng)，施加不同應力，觀察到當施加靜壓力90kPa 60min時，細胞體積變大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹。而當施加時間為360min時，則出現(xiàn)凋亡小體。張旻等［14］也發(fā)現(xiàn)對髁突軟骨細胞施加90kPa的應力6h后細胞部分出現(xiàn)明顯的細胞凋亡指征。此外，Sharawy等［15］建立兔關節(jié)盤前移位動物模型，觀察到軟骨細胞凋亡增加及軟骨細胞基質(zhì)中膠原類型的改變，提示不同的應力會影響軟骨細胞的凋亡及基質(zhì)的結(jié)構，本實驗中未見到明顯的凋亡小體，可能與觀察面積局限，而髁突軟骨細胞凋亡未廣泛分布所致。

以上研究表明異常的應力作用于髁突軟骨，會引起軟骨表面膠原纖維結(jié)構的改變，且隨應力改變程度不同而不同，纖維結(jié)構的變化使髁突表層容易受磨耗。同時手術側(cè)髁突軟骨細胞更多的成熟分化為骨組織，使軟骨細胞數(shù)目減少。單獨或二者聯(lián)合的結(jié)果使手術側(cè)髁突形狀變小。同時，隨著時間延長，手術側(cè)髁突未觀察到明顯的修復發(fā)生，手術側(cè)髁突體積隨著時間未能恢復正常，提示在髁突的生長發(fā)育期內(nèi)，由骨折等外傷原因引起的異常應力可能會對髁突的超微結(jié)構產(chǎn)生一定的損害，影響髁突的形狀，進而影響頜面部的形態(tài)及功能。此外，由于電鏡技術本身的限制，有關形態(tài)變化與髁突軟骨細胞功能的關聯(lián)有待于結(jié)合其他研究方法和手段進一步深入研究。

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