秦 川，陳 林，肖穎彬

（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍心血管外科研究所，重慶400037）

促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是機(jī)體遭遇缺氧時(shí)為缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factors，HIFs）激活后上調(diào)表達(dá)的重要細(xì)胞因子［1］，其促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖及分化為成熟紅細(xì)胞，以增加循環(huán)血液中紅細(xì)胞數(shù)量及血紅蛋白含量，提高血液攜氧能力應(yīng)對(duì)缺氧。但近年研究證實(shí)，促紅細(xì)胞生成素受體（erythropoietin receptor，EPOR）能夠表達(dá)于心肌細(xì)胞，提示EPO 能夠直接作用于心肌細(xì)胞EPOR 產(chǎn)生相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)EPO 能夠顯著增強(qiáng)慢性缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞的線粒體生物合成水平，因而可能影響線粒體的能量代謝功能而參與心肌細(xì)胞對(duì)慢性缺氧的適應(yīng)過程［2］，然而其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍有待闡明。一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）是NO 合成的主要調(diào)節(jié)蛋白，通過催化L-精氨酸合成NO，從而啟動(dòng)線粒體生物合成［3］。為此，本研究擬通過采用shRNA 干擾eNOS基因表達(dá)的方法觀察干預(yù)eNOS后對(duì)EPO 調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞線粒體生物合成作用的影響，從而探討其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 H9c2心肌細(xì)胞（ATCC細(xì)胞庫）；蛋白磷酸酶抑制劑（普利萊）；eNOS、p-eNOS（ser1 177）抗體（兔抗大鼠；Cell Signaling Technology公司）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳液、BCA 試劑盒、SDS裂解液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（碧云天公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；MitoTracker 線粒體綠色熒光探針（Invitrogen公司）；基因組DNA 提取試劑盒、SYBR?Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa公司）；rhEPO（沈陽三生公司）；eNOS shRNA質(zhì)粒［Nos3-RNAi（2984-1）］由吉?jiǎng)P公司構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞慢性缺氧模型建立 采用缺氧培養(yǎng)箱，將H9c2心肌細(xì)胞于缺氧環(huán)境中（94% N2，5% CO2，1% O2）培養(yǎng)，2d換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液1次，培養(yǎng)1周建立慢性缺氧模型。將慢性缺氧H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板，細(xì)胞數(shù)量為5×105個(gè)，制作細(xì)胞爬片。

1.2.2 eNOS的特異性RNA 干擾 eNOS的特異性shRNA質(zhì)粒靶序列為：5′-GCG TGG AGT GTT TGG ACA AGT CC-3′。質(zhì)粒內(nèi)含有抗新霉素基因用于藥物篩選，也含有GFP基因可用于流式細(xì)胞儀進(jìn)一步篩選。采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，具體如下：當(dāng)細(xì)胞在6孔板內(nèi)生長至融合率達(dá)90%以上時(shí)，于每孔加入150μL無血清培養(yǎng)基稀釋的12μg質(zhì)粒DNA（包括空白對(duì)照質(zhì)粒和目的質(zhì)粒）以及無血清培養(yǎng)基138μL 稀釋的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 12μL，再加入無血清培養(yǎng)基700 μL，于37 ℃培養(yǎng)24h，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率為30%～40%。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀篩選，觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染率升至約70%，改用含新霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，維持轉(zhuǎn)染率。

1.2.3 分組 未加入rhEPO 的慢性缺氧細(xì)胞為缺氧對(duì)照組（HC組），以20U／mL 的rhEPO 處理的慢性缺氧細(xì)胞為HE組，以20 U／mL rhEPO 處理轉(zhuǎn)染了eNOS的特異shRNA 質(zhì)粒的慢性缺氧細(xì)胞為HR 組。

1.2.4 線粒體熒光探針染色 細(xì)胞于缺氧培養(yǎng)1周后，細(xì)胞爬片以PBS漂洗3次。將線粒體綠色熒光探針用二甲基亞砜（DMSO）稀釋為1mmol／L，再用DMEM 稀釋至100mmol／L。將制備好的工作液與細(xì)胞爬片于室溫孵育25 min后，以激光共聚焦顯微鏡觀察，線粒體數(shù)量以綠色熒光光密度值計(jì)算。

1.2.5 實(shí)時(shí)-PCR（RT-PCR） 首先提取處理后的細(xì)胞總DNA，以細(xì)胞核基因組的β-actin 作為參照基因，細(xì)胞色素c（Cyt）作為目的基因。采用Primer Premier 5.0軟件對(duì)以上基因PCR 引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工合成。Cyt：上游引物5′-CCG GAG CAA TCC AGG TCG GTT-3′；下游引物5′-TGG TTG GGA GCA CTT ATG GTA AGG A-3′，β-actin：上游引物5′-TCC CGG CCC CTA GGG TGT AGA-3′；下游引物5′-GCC GCA CCG GCT CTC CAA AT-3′。采用SYBR Green染色法，于7500Fast RT-PCR系統(tǒng)上進(jìn)行反應(yīng)：94℃30s，60℃30s，72 ℃1min，共40個(gè)循環(huán)。所有的RT-PCR 至少重復(fù)3次，溶解曲線驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性，Cyt為97bp片段，β-actin為136bp片段。采用2-△△CT法［4］計(jì)算線粒體相對(duì)拷貝數(shù)。

1.2.6 Western blot 收集處理過的細(xì)胞，加入1mL SDS細(xì)胞裂解液，同時(shí)加入10μL PMSF及1μL 磷酸化蛋白降解抑制劑，于0 ℃孵育30min，超聲破碎，12 000r／min離心5min提取總蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量后，將其于8%的SDS-PAGE在100V 下電泳2h。再于250mA 恒流電下100 min電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。封閉液于室溫封閉2h，加入一抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶5 000），室溫下空氣搖床中搖動(dòng)100min。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，采集圖片后以Quantity One軟件進(jìn)行分析，灰度值表示蛋白表達(dá)量，以β-actin為參照基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，RTPCR，Western blot結(jié)果采用單因素方差分析，結(jié)果均滿足方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用±s表示，兩兩比較采用LSD-q法。線粒體數(shù)量采用平均光密度值計(jì)算，用單因素方差分析為方差不齊，改用獨(dú)立樣本的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 eNOS的特異性shRNA 干擾 經(jīng)過特異性shRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染處理，并經(jīng)過流式細(xì)胞儀篩選，轉(zhuǎn)染率由30%～40%升至約70%。見圖1。

圖1 eNOS 特異性shRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的H9c2心肌細(xì)胞（×200）

2.2 線粒體數(shù)量變化 同HC 組比較，HE 組綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，即rhEPO 能顯著增加慢性缺氧心肌細(xì)胞線粒體數(shù)量（P＜0.05），但HR 組線粒體數(shù)量較HE 組顯著減少（P＜0.05）。見圖2。

圖2 線粒體熒光探針檢測(cè)線粒體數(shù)量（激光共聚焦顯微鏡×1 000）

2.3 eNOS蛋白表達(dá)及磷酸化變化 同HC組比較，HE 組細(xì) 胞經(jīng)rhEPO 處理后eNOS總蛋白表達(dá)無影響，但顯著促進(jìn)其磷酸化（P＜0.05），HR 組心肌細(xì)胞eNOS的特異RNA 干擾顯著降低eNOS蛋白表達(dá)及磷酸化水平（P＜0.05）。見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)eNOS蛋白及磷酸化表達(dá)水平變化

2.4 線粒體相對(duì)拷貝數(shù)變化 HE 組線粒體相對(duì)拷貝數(shù)較HC組增加（P＜0.05），但在HR 組較HE 組減少（P＜0.05）。見圖4。

圖4 RT-PCR檢測(cè)線粒體相對(duì)拷貝數(shù)變化

3 討 論

先天性心臟病的發(fā)病率約為4／1 000～50／1 000［4-5］，其中紫紺型先天性心臟病對(duì)兒童健康乃至生命的威脅更為明顯。盡管在我國越來越多的紫紺型先心病患者已得到了及時(shí)正確的治療，然而其病死率仍較高，遠(yuǎn)期療效也不確定。還有部分患者可能終身無法接受根治手術(shù)。慢性缺氧是此類患者的共同病理生理過程。由于心臟高度需氧，因此對(duì)缺氧也極為敏感。然而，紫紺型先心病患者的心臟卻能夠耐受缺氧，生存并發(fā)揮功能，其機(jī)制亟待研究。缺氧時(shí)會(huì)造成能量應(yīng)激，慢性缺氧時(shí)，心肌細(xì)胞必然發(fā)生一系列分子生物學(xué)變化，進(jìn)而適應(yīng)并生存，其中線粒體作為心肌細(xì)胞關(guān)鍵的能量來源，其適應(yīng)性的變化尤為重要。研究已證實(shí)紫紺型先天性心臟病患者的心肌細(xì)胞出現(xiàn)了線粒體生物合成顯著增強(qiáng)的現(xiàn)象，線粒體生物合成作為線粒體自我復(fù)制和更新的重要過程，在慢性缺氧的心肌中出現(xiàn)，提示線粒體生物合成的增強(qiáng)可能是心肌細(xì)胞對(duì)慢性缺氧適應(yīng)的重要機(jī)制。然而，其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

EPO 是經(jīng)典的造血細(xì)胞因子，主要用于治療貧血。近年發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞表達(dá)EPOR，提示EPO 可以直接作用于心肌細(xì)胞并產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，多項(xiàng)研究也對(duì)此進(jìn)行了報(bào)道［6-8］。由于在慢性缺氧時(shí)循環(huán)血液中EPO 的濃度顯著升高［9］，同時(shí)心肌中的EPOR 表達(dá)也顯著增加［10-11］，提示心肌細(xì)胞EPO-EPOR信號(hào)增強(qiáng)，然而其生物學(xué)效應(yīng)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)EPO調(diào)節(jié)慢性缺氧心肌細(xì)胞線粒體生物合成的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)EPO 顯著增強(qiáng)慢性缺氧心肌細(xì)胞線粒體生物合成水平，且呈劑量依賴性。

在本研究中，通過采用eNOS的特異性RNA 干擾，首先發(fā)現(xiàn)EPO 對(duì)慢性缺氧心肌細(xì)胞eNOS的總蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響，但卻顯著增強(qiáng)其磷酸化，提示EPO 可以通過使eNOS磷酸化的途徑使之激活，推測(cè)這一作用與Akt的活化有關(guān)，因?yàn)閑NOS的1 177Ser為Akt磷酸化位點(diǎn)［12］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，RNA 干擾使eNOS的蛋白表達(dá)及磷酸化水平顯著降低，同時(shí)，也使EPO 增強(qiáng)慢性缺氧心肌細(xì)胞線粒體生物合成的作用顯著減弱，證實(shí)了eNOS通過磷酸化活化參與了EPO 調(diào)節(jié)慢性心肌細(xì)胞線粒體生物合成的效應(yīng)。

通過本研究，作者進(jìn)一步深入探討了EPO 調(diào)節(jié)慢性缺氧心肌細(xì)胞線粒體生物合成的作用機(jī)制，對(duì)深入闡釋增強(qiáng)的EPO-EPOR信號(hào)在心肌細(xì)胞對(duì)慢性缺氧適應(yīng)中作用以及心肌對(duì)慢性缺氧環(huán)境適應(yīng)機(jī)制具有一定的意義。

［1］ Hewitson KS，McNeill LA，Schofield CJ.Modulating the hypoxia-inducible factor signalling pathway：applications from cardiovascular disease to cancer［J］.Curr Pharm Des，2004，10（8）：821-833.

［2］ 周勝凱，秦川，陳林，等.EPO 對(duì)慢性缺氧心肌細(xì)胞線粒體生物合成的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（12）：1192-1196.

［3］ Nisoli E，Clementi E，Moncada S，et al.Mitochondrial biogenesis as a celluar signaling framework［J］.Biochem Pharmacol，2004，67（1）：1-15.

［4］ Trinei M，Berniakovich I，Ppelicci PC，et al.Mitochondrial DNA copy number is regulated by cellular proliferation：a role for Ras and p66（Shc）［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1757（5／6）：624-630.

［5］ Hoffman JI，Kaplan S.The incidence of congenital heart disease［J］.J Am Coll Cardiol，2002，39（12）：1890-1900.

［6］ Fu P，Arcasoy MO.Erythropoietin protects cardiac myocytes against anthracycline-induced apoptosis［J］.Biochem Bioph Res Co，2007，354（2）：372-378.

［7］ Mao W，Iwai C，Liu J，et al.Darbepoetinalfa exerts a cardioprotective effect in autoimmune cardiomyopathy via reduction of ER stress and activation of PI3K／Akt and STAT3pathways［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，45（2）：250-260.

［8］ Yamada Y，Kobayashi H，Iwasa M，et al.Postinfarct active cardiac-targeted delivery of erythropoietin by liposomes with sialyl Lewis X repairs infarcted myocardium in rabbits［J］.Am J Physiol-Heart C，2013，304（8）：H1124-1133.erythropoietin production：aparadigm for oxygen-regulated gene expression［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2006，33（10）：968-979.

［10］ Hasnaoui-Saadani RE，Marchant D，Pichon A，et al Epo deficiency alters cardiac adaptation to chronic hypoxia［J］.Respir Physiol Neurobiol，2013，186（2）：146-154.

［11］ Warnecke C，Zaborowska Z，Kurreck J，et al.Differenciating the functional role of hypoxia-inducible factor（HIF）-1alpha target gene in Hep3Band Kelly cells［J］.FASEB J，2004，18（12）：1462-1464.

［12］ Liang C，Ren Y，Tan H，et al.Rosiglitazone via upregulation of Akt／eNOS pathways attenuates dysfunction of endothelial progenitor cells，induced by advanced glycation end products［J］.Br J Pharmacol，2009，158（8）：1865-1873.