劉迎新 鄒大威 耿建國 高彥彬 尚雅文 李嬌陽 龔慕辛 彭麒朕

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的首要因素［1］。DN病理表現(xiàn)為腎小球硬化(腎小球基底膜增厚、腎小球肥大、系膜基質(zhì)增多)和腎小管間質(zhì)纖維化(成纖維細(xì)胞的增生及由此造成的細(xì)胞外基質(zhì)過度堆積)［2-3］。近年研究發(fā)現(xiàn)，血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)與其相應(yīng)受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)結(jié)合，通過多種信號通路發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增生、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)增生作用，在DN腎纖維化進(jìn)程中起到了促進(jìn)作用。本課題采用自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立糖尿病腎病模型，通過觀察糖腎寧對腎組織PDGF、PDGFR蛋白表達(dá)的影響，探討糖腎寧防治糖尿病腎病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

8周齡SPF級雄性KK-Ay小鼠60只，8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠20只，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號SCXK(京)2014-0004。KK-Ay小鼠高脂飼料(購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號SCXK(京)2009-0008)。

1.2 藥物

糖腎寧(主藥配比:黃芪4份、金櫻子2份、川芎2份、大黃1份、葛根2份，由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥制劑室制備成浸膏粉);纈沙坦膠囊(商品名:代文，規(guī)格:80 mg/粒，批號 X1448，北京諾華制藥有限公司)。

1.3 主要試劑

Anti-PDGF antibody(Abcam，ab125268)，PDGF Receptor beta(Epitomics，1469-1)。尿白蛋白酶聯(lián)免疫測定試劑盒(ICL，批號:29S1)，麗春紅(國家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，CAS:123334-10-1)，冰醋酸(國家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，CAS:3761-53-3)，苯胺藍(lán)(國家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，CAS:8004-91-9)。

1.4 主要儀器

電子天平(YP601N，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，血糖儀(One touch ultra，強(qiáng)生中國醫(yī)療器械有限公司)，酶標(biāo)儀(MR-96A，深圳邁瑞)，顯微攝像系統(tǒng)(Nikon Eclipse 80i，北京瑞馳恒業(yè)儀器科技有限公司)。

1.5 模型建立與分組

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料誘導(dǎo)自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立糖尿病腎病模型［4-5］:KK-Ay小鼠60只高脂飼料喂養(yǎng)4周后，測隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，尿微量白蛋白明顯增多視為糖尿病腎病造模成功。造模成功的KK-Ay小鼠隨機(jī)分為模型組、纈沙坦組、糖腎寧組各20只。采用C57BL/6J小鼠20只作為空白組。KK-Ay小鼠飼以高脂飼料，C57BL/6J小鼠飼以普通飼料。糖腎寧組按生藥20 g/(kg·d)灌胃，纈沙坦組按10 mg/(kg·d)灌胃，模型組及空白組予等量蒸餾水灌胃，實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食飲水，連續(xù)給藥12周。

1.6 標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)

灌胃期間，動態(tài)監(jiān)測小鼠體質(zhì)量和血糖。于給藥12周，將各組小鼠置于代謝籠中收集24小時(shí)尿液并記錄尿量，采用ELISA酶聯(lián)免疫學(xué)方法檢測24小時(shí)尿微量白蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAER)。各組小鼠連續(xù)給藥12周后，禁食12小時(shí)，5%水合氯醛按0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，取出雙側(cè)腎臟，部分腎組織用4%多聚甲醛固定，Masson染色觀察腎組織纖維化的病變程度，顯微鏡圖像分析技術(shù)軟件半定量分析膠原纖維染色陽性面積。Western Blot方法檢測腎組織中 PDGF及PDGFR蛋白表達(dá)。剩余尿樣及腎組織－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各指標(biāo)組間比較均采用單因素方差分析(ANOVA)，方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane’s T2非參數(shù)檢驗(yàn)。體質(zhì)量、血糖、UAER、膠原纖維染色陽性面積、PDGF及PDGFR蛋白表達(dá)等指標(biāo)組間方差不齊，采用Tam-hane’s T2非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖腎寧對體重的影響

8周齡時(shí)，與空白組相比，模型組小鼠體重顯著增加(P＜0.05);與模型組相比，纈沙坦組、糖腎寧組小鼠體重?zé)o明顯變化(P＞0.05)。灌胃期間KKAy小鼠飼以高脂飼料，C57BL/6J小鼠飼以普通飼料。24周齡時(shí)，與空白組相比，模型組、纈沙坦組、糖腎寧組小鼠體重顯著增加(P＜0.05);與模型組相比，纈沙坦組、糖腎寧組小鼠體重?zé)o明顯變化(P＞0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量的比較(x ± s，g)

2.2 糖腎寧對血糖的影響

8周齡及24周齡時(shí)，與空白組比較，模型組、纈沙坦組及糖腎寧組血糖均明顯升高(P＜0.05)，模型組、纈沙坦組及糖腎寧組之間無明顯差異(P＞0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血糖的比較(x ± s，mmol/L)

2.3 糖腎寧對24小時(shí)尿微量白蛋白排泄率的影響

給藥12周后，與空白組相比，模型組、糖腎寧組及纈沙坦組24小時(shí)UAER明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比，糖腎寧及纈沙坦組小鼠24小時(shí)UAER明顯降低(P＜0.05)。見表3。

表3 給藥12周各組小鼠24小時(shí)尿白蛋白定量比較(±s)

表3 給藥12周各組小鼠24小時(shí)尿白蛋白定量比較(±s)

注:與空白組比較，aP ＜0.05;與模型組比較，bP ＜0.05。

組別 n 尿白蛋白排泄率(ug/24h)空白組12 126.75 ±29.64模型組 12 3486.12 ±601.30a纈沙坦組 12 2723.67 ±531.91ab糖腎寧組 12 2743.17 ±553.66ab

2.4 糖腎寧對腎組織病理改變的影響

綠染區(qū)主要為膠原纖維成分。空白組:腎組織形態(tài)正常，腎小球無腫大，腎小管排列整齊，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常?；啄ぁ⑾的せ|(zhì)染成綠色，腎小管見少量染成綠色的膠原纖維。模型組:腎小球肥大，大量腎小管上皮細(xì)胞呈空泡樣病變，系膜基質(zhì)區(qū)擴(kuò)大。腎小球系膜區(qū)及腎小管間質(zhì)膠原纖維明顯增多，可見大量綠染的膠原纖維。纈沙坦組和糖腎寧組:腎小球均輕度肥大，腎小管排列較整齊，腎小管上皮細(xì)胞成空泡樣病變，但較模型組病變程度輕，系膜區(qū)及細(xì)胞外基質(zhì)綠染面積較模型組明顯減少。見圖1。

顯微鏡圖像分析系統(tǒng)半定量分析膠原纖維染色陽性面積結(jié)果可見:模型組、纈沙坦組及糖腎寧組腎組織膠原纖維染色陽性面積較空白組明顯增多(P＜0.05);纈沙坦組和糖腎寧組腎組織膠原纖維染色陽性面積較模型組顯著降低(P＜0.05)，各給藥組之間無明顯差異(P＞0.05)。見表4。

圖1 各組小鼠腎組織病理改變比較

表4 各組小鼠膠原纖維染色陽性面積比較(±s)

表4 各組小鼠膠原纖維染色陽性面積比較(±s)

注:與空白組比較，aP ＜0.05;與模型組比較，bP ＜0.05。

組別 n 相對面積(%)10 4.48 ±0.31模型組 10 13.39 ±2.70a纈沙坦組 10 6.60 ±1.05ab糖腎寧組 10 7.86 ±1.03空白組ab

2.5 糖腎寧對PDGF、PDGFR蛋白表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果表明:模型組小鼠 PDGF、PDGFR相對蛋白表達(dá)量較空白組顯著增加(P＜0.05)，糖腎寧及纈沙坦組相對蛋白表達(dá)量較模型組顯著降低(P＜0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠腎組織PDGF、PDGFR蛋白表達(dá)比較

3 討論

KK-Ay小鼠是一種毛色基因Ay突變的2型糖尿病小鼠，16周齡以后便開始出現(xiàn)明顯的肥胖、多尿、高血糖、高胰島素血癥和高脂血癥等代謝綜合征，符合2型糖尿病動物模型的特點(diǎn)［6］。此外，遺傳因素和環(huán)境因素共同參與了KK-Ay小鼠糖尿病的發(fā)生，與人類2型糖尿病非常相似［7］。

PDGF屬于血管內(nèi)皮生長因子家族，是目前已知多肽生長因子中最強(qiáng)的有絲分裂原。DN時(shí)葡萄糖和糖基化產(chǎn)物可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞持續(xù)表達(dá)PDGF基因及其β受體，繼而促進(jìn)系膜細(xì)胞的增生和Ⅲ型膠原的產(chǎn)生［8］。此外葡萄糖、糖基化產(chǎn)物還可通過PDGF的表達(dá)，刺激轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF-β)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)釋放，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)積聚和抑制 ECM降解，從而使腎臟出現(xiàn)纖維化［9-10］。徐惠等［11］發(fā)現(xiàn)大鼠單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型中受損的腎小管過度表達(dá)PDGF-B及PDGFR-β，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的形成和Ⅲ型膠原的沉積，合成大量的ECM，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎功能惡化。Ostendorf T［12］等通過對UUO模型采用特殊的抗PDGF治療，腎纖維化大鼠腎小管間質(zhì)纖維化損傷明顯減少，間質(zhì)成纖維細(xì)胞沉積明顯減少，白血球浸潤減少。由此可見PDGF及PDGFR在DN腎纖維化進(jìn)程中起到了重要的促進(jìn)作用。

中醫(yī)認(rèn)為DN多屬“消渴”“腎消”“水腫”“虛勞”等病證范疇，病位在腎，多因消渴日久遷延及腎、絡(luò)脈瘀阻、腎體受損而成。病性多虛實(shí)夾雜，治療上以扶正祛邪為主。糖腎寧由黃芪、金櫻子、大黃、川芎等藥物組成，具有益氣固腎、化瘀通絡(luò)降濁之功。方中黃芪益氣扶正，金櫻子固精縮尿，大黃逐瘀清熱降濁，川芎活血化瘀通絡(luò)。早期糖腎寧臨床隨機(jī)雙盲對照前瞻性研究［13-14］證實(shí)該藥可明顯降低DN患者尿白蛋白，保護(hù)腎功能，安全有效。

本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)糖腎寧能夠明顯降低尿白蛋白，抑制腎臟纖維化，保護(hù)腎功能。推測其作用機(jī)理可能與糖腎寧抑制PDGF及PDGFR蛋白的過度表達(dá)，減輕腎臟損傷有關(guān)，其詳細(xì)機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。

［1］鄧子玄，周健，賈偉平.2014年美國糖尿病學(xué)會糖尿病醫(yī)學(xué)診治標(biāo)準(zhǔn)更新內(nèi)容解讀［J］.中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版)，2014，6(1):66-73.

［2］呂萌，胡高云，涂志軍，等.糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制及抗糖尿病腎病化合物的研究進(jìn)展［J］.中國新藥雜志，2014，23(10):1139-1145.

［3］汪建云，印曉星.糖尿病腎病中轉(zhuǎn)化生長因子-β_1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與腎纖維化［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10(4):371-376.

［4］Furukawa M，Gohda T，Tanimoto M，et al.Pathogenesis and Novel Treatment from the Mouse Model of Type 2 Diabetic Nephropathy［J］.The Scientific World Journal，2013，62(2):148-154.

［5］Sasaki M，Uehara S，Ohta H，et al.Losartan ameliorates progression of glomerular structural changes in diabetic KKAy mice［J］.Life Sciences，2004，75(7):869-880.

［6］陳麗萌，李學(xué)旺，黃利偉，等.2型糖尿病小鼠(KKA～y)動物模型的鑒定和早期腎臟病理改變［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，24(1):71-75.

［7］郭清華，陸菊明，潘長玉.飲食能量對Kkay及Kk小鼠2型糖尿病發(fā)病的影響［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，26(2):140-142.

［8］戎贊華，段惠軍.血小板源性生長因子與腎臟疾病的研究進(jìn)展［J］.河北醫(yī)藥，2010，32(7):857-860.

［9］丁新，盛宏光.糖尿病大鼠腎皮質(zhì)PDGF、LOX-1、TGF-β 的基因表達(dá)探討［J］.中國臨床醫(yī)學(xué)，2006，13(3):443-444.

［10］趙任杰，李均.PDGF及PDGFR在腎間質(zhì)纖維化中的研究進(jìn)展［J］.西部醫(yī)學(xué)，2013，25(5):798-799.

［11］徐惠，官陽，楊木蘭，等.PDGF及PDGFR在大鼠腎間質(zhì)纖維化過程中的作用［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(19):2354-2358.

［12］Ostendorf T，Eitner F，F(xiàn)loege J.The PDGF family in renal fibrosis［J］.Pediatric Nephrology，2012，27(7):1041-1050.

［13］高彥彬，趙慧玲，關(guān)崧，等.糖腎寧治療氣陰兩虛、絡(luò)脈瘀滯型早期糖尿病腎病臨床研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，21(7):409-411.

［14］高彥彬，呂仁和，王秀琴，等.糖腎寧治療糖尿病腎病的臨床研究［J］.中醫(yī)雜志，1997，38(2):96-99.

(本文編輯:董歷華)