許淑紅，尹茂山，吳玉林

(1.中國藥科大學藥學院，江蘇南京 211198;2.濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東濟南 250200;3.山東省醫(yī)學科學院藥物研究所，山東 濟南 250062)

腦水腫是缺血性腦卒中、顱腦創(chuàng)傷等眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病共同的病理過程［1］。腦組織的進行性水腫使顱內(nèi)壓升高，腦的血流量減少，是導致腦功能障礙和死亡的主要原因之一。水通道蛋白4(aquaporin，AQP4)是膜水通道蛋白家族的一員，在腦組織中廣泛表達，是控制水出腦組織的通道，在腦組織水平衡、星形細胞遷移、神經(jīng)興奮及炎癥等方面均起著重要作用［2］。大量研究［2－3］表明，AQP4 與腦水腫關(guān)系密切，AQP4在星形膠質(zhì)細胞周足處表達明顯，調(diào)控水分子出入腦組織，因此在腦水腫的形成和消退的各個階段起著重要作用，參與了多種疾病所引起的腦水腫的病理過程。進一步研究［4－6］顯示，AQP4定位于星形膠質(zhì)細胞(astrocyte，Ac)上，被發(fā)現(xiàn)在腦水腫的形成中能明顯促進Ac的腫脹，AQP4作為一個潛在的藥物作用靶點成為預防和治療腦水腫的研究熱點之一。腦水腫形成的因素很多，其中血小板功能異常是參與腦血栓形成的重要因素，與腦水腫關(guān)系密切。奧扎格雷鈉是TXA2合成酶抑制劑，抑制TXA2的生成，抑制血小板聚集，同時促進PGI2的產(chǎn)生，從而使凝血過程受到有效抑制，達到改善微循環(huán)，增加腦血液供應，達到消除腦水腫的作用。臨床試驗［7］證明，奧扎格雷鈉具有見效快、療程短、價格適中、無毒副作用等諸多優(yōu)點。吡拉格雷鈉(tetramethylpyrazine-2'-O-sodium ferulate，TSF)是以奧扎格雷鈉為先導物進行改良的結(jié)構(gòu)新型的血栓烷素A2合成酶抑制劑。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，吡拉格雷可以明顯減輕大鼠腦缺血/再灌注后的腦水腫，很好地保護血腦屏障的完整性，但其減輕腦水腫的具體途徑及機制目前都尚不清楚。本研究通過對體外星形膠質(zhì)細胞行氧糖剝奪/復氧處理，建立細胞水腫模型，觀察TSF對星形膠質(zhì)細胞水腫模型的治療效果及其對AQP4表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

1.1.1 實驗動物 出生3 d內(nèi)的SD新生乳鼠(由江蘇大學動物中心提供)。

1.1.2 材料及試劑 戊巴比妥鈉(美國Sigma公司);胎牛血清，0.25%胰蛋白酶(含0.025%EDTA)，DMEM無糖培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基(美國Sig-ma公司);D-Hanks緩沖液;3-氧 － 甲基-［1-3H］-D-葡萄糖;根皮素;NaOH溶液;HCl溶液;BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime公司);AQP4一抗(Abcam公司);酶標儀;低溫離心機;二氧化碳孵箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng) 取SD乳鼠腦組織，用預冷D-Hanks緩沖液清洗表面血跡，并快速除去腦膜和血管，制備單細胞懸液，以上操作均在無菌條件下進行。將單細胞懸液接種入培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶置于二氧化碳孵箱(5%CO2，20%O2)，37℃恒溫培養(yǎng)1 h;將細胞懸液轉(zhuǎn)換至另一培養(yǎng)瓶，繼續(xù)置于二氧化碳孵箱培養(yǎng)，隔2～3 d換液，7 d后于37℃，200 r·min－1振蕩 18 h，換液，細胞長滿至90%～95%瓶底時，以0.25%胰蛋白酶消化離心，重復傳代至第3代，此時即得到成熟純化的原代星形膠質(zhì)細胞［8］。

1.2.2 氧糖剝奪/復氧星形膠質(zhì)細胞水腫模型的建立 棄去星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)瓶中的正常培養(yǎng)基，PBS快速沖洗2次。加入無糖DMEM培養(yǎng)基，置于低氧(1%O2，5%CO2)孵箱，進行2 h的氧糖剝奪培養(yǎng);氧糖剝奪后，棄去無糖DMEM培養(yǎng)基，置于DMEM/F 12培養(yǎng)基，正常條件培養(yǎng)。

1.2.3 實驗分組 將體外原代星形膠質(zhì)細胞分為4個組:① 正常組:正常星形膠質(zhì)細胞在二氧化碳孵箱(5%CO2，20%O2)，37℃ 恒溫，以 10% 胎牛血清的DMEM/F 12培養(yǎng)基培養(yǎng);② 氧糖剝奪/復氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/Reox)損傷組:將正常星形膠質(zhì)細胞進行2 h氧糖剝奪培養(yǎng)，恢復正常條件培養(yǎng)至6、12、24和48 h 4個時間點;③ Ozagrel陽性對照組:在星形膠質(zhì)細胞行OGD/Reox損傷各時間點在細胞培養(yǎng)基中加入治療濃度的Ozagrel治療;④ TSF治療組:星形膠質(zhì)細胞OGD/Reox損傷模型建立后各時間點在細胞培養(yǎng)基中加入不同濃度梯度的TSF治療。

1.2.4 細胞體積測定 各時間點實驗結(jié)束前30 min，加3-氧 － 甲基-［1-3H］-D-葡萄糖于細胞培養(yǎng)基中，使其終濃度為1.85×108Bq·L－1，以此作示蹤物測定細胞體積。各時間點取樣，用預冷根皮素(1 mmol·L－1)培養(yǎng)基快速洗6遍，以終止反應，NaOH消化10 min，以等濃度HCl中和，加閃爍液混勻，取0.5 mL用于流體閃爍計數(shù)，取0.1 mL用于BCA法蛋白質(zhì)含量測定，換算成細胞內(nèi)水含量(Kletzien法)，結(jié)果以L·g－1蛋白表示。

1.2.5 LDH漏出率測定 星形膠質(zhì)細胞分別在氧糖剝奪/復氧培養(yǎng)至各時間點，各組取約0.3 ml細胞培養(yǎng)液，測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性，結(jié)果計算采用公式:LDH漏出率/%=［培養(yǎng)基 LDH/(胞質(zhì) LDH+培養(yǎng)基 LDH)］×100%。

1.2.6 星形膠質(zhì)細胞活性鑒定(MTT法) 取星形膠質(zhì)細胞以1×108·L－1密度種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL，每組設6個復孔，培養(yǎng)至所需的天數(shù)，DMEM培養(yǎng)基沖洗3次，加5 μL的MTT(5 g·L－1)，孵育4 h，棄去 MTT及培養(yǎng)基，每孔加入200 μL的二甲基亞砜，振蕩5 min，酶標儀(A570 nm)測定，取均值，采用公式計算結(jié)果:細胞存活率/%=［A(實驗組)/A(對照組)］×100%。

1.2.7 Western blot測定星形膠質(zhì)細胞AQP4蛋白表達水平 去除培養(yǎng)液，加入蛋白裂解液，置于冰上裂解20 min;4℃下14 000×g離心10 min，取上清，用BCA法測定總蛋白濃度。30～50 μg總蛋白上樣量以濃度為8%的凝膠電泳分離。冰水浴下恒流(300mA)濕法轉(zhuǎn)膜1.5 h，以體積分數(shù)5%的脫脂奶粉封閉1 h，加AQP4一抗(1∶300)，4℃共孵育過夜。TBS-T洗滌，與二抗共孵育2 h，用增強型化學發(fā)光試劑進行顯色，并利用灰度分析軟件定量分析，以β-actin的灰度值標化蛋白表達水平。

1.2.8 RT-PCR測定星形膠質(zhì)細胞AQP4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 取各組別星形膠質(zhì)細胞，均勻粉碎后按TRIzol提取程序(說明書)提取組織總 RNA;按AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行逆轉(zhuǎn)錄后，4℃保存。擴增引物:AQP4上游引物5'-GGAATTTCTGGCCATGCTTA-3'，下游引物 5'-AAGACAGACTTGGCGATGCT-3'，擴增片段產(chǎn)物長231 bp。β-actin上游引物5'-CTGCCGCATCCTCTTCCTC-3'，下游引物5'-CTCCTGCTTGCTGATCCACTA-3'，擴增產(chǎn)物長398 bp。擴增條件:94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，共35個循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀觀察，用 Band Scan 5.0軟件測定條帶灰度值，將AQP4 mRNA、分別與β-actin mRNA灰度值的比值作為觀察指標，進行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，組間比較均采用單因素方差分析(One-way analysis of variance，ANOVA)處理。

2 結(jié)果

2.1 TSF對OGD/Reox后星形膠質(zhì)細胞體積變化的影響

2.1.1 OGD/Reox后不同時間點星形膠質(zhì)細胞體積變化 經(jīng)過2 h時長的氧糖剝奪后，星形膠質(zhì)細胞不同時間點細胞體積隨著時間延長呈不斷增高趨勢。與正常組相比，OGD/Reox后48 h時差異有顯著性(P ＜0.01)。見 Tab 1、Fig 1。

Tab 1 Changes of astrocytes volume in different time points(±s，n=6)

Tab 1 Changes of astrocytes volume in different time points(±s，n=6)

#P＜0.05，##P＜0.01 vs control

Group Control Time points after OGD/Reox 6 h 12 h 24 h 48 h Cell volume 5.49 ±0.44 6.33 ±0.64 6.81 ±0.41 7.20 ±0.45#7.67 ±0.38##

Fig 1 Changes of astrocytes volume in different time points(±s，n=6)

2.1.2 不同濃度梯度TSF對OGD/Reox后48 h星形膠質(zhì)細胞體積的影響 星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪2 h復氧48 h后，與模型組相比，不同濃度梯度的TSF(10－7、10－6、10－5、10－4mol·L－1)處理的細胞體積均有明顯降低(P＜0.05)，各濃度梯度之間差異無顯著性(P＞0.05);Ozagrel組與TSF組各濃度梯度之間差異也無顯著性(P＞0.05)。見Tab 2、Fig 2。

Fig 2 Effects of different concentrations of TSF on astrocytes volume after OGD/Reox(±s，n=6)

2.1.3 LDH漏出率檢測結(jié)果 實驗表明，正常供氧條件下，LDH漏出率也僅為2.3%，氧糖剝奪2 h復氧后各時間點隨著復氧時間的延長LDH的漏出率增加，與正常對照組差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01)，與模型組對比，TSF給藥組的LDH漏出率明顯降低(P＜0.05);Ozagrel組與TSF組各濃度梯度之間差異無顯著性(P＞0.05)。見Tab 3、Fig 3。

Fig 3 The leakage rate of LDH in astrocytes(±s，n=6)

2.2 MTT檢測細胞活力結(jié)果與正常組相比，OGD 12、24和48 h細胞的MTT值明顯降低(P＜0.05)，比較星形膠質(zhì)細胞OGD/Reox后各個時間點MTT值，隨缺氧/復氧時間增加，MTT值逐漸下降，顯示細胞活力降低;與OGD/Reox比較，TSF治療組細胞活力均有增高(P＜0.05);Ozagrel組與TSF組各濃度梯度之間差異也無顯著性(P＞0.05)。見 Fig 4、5。

Fig 4 Changes of MTT in OGD/Reox group(±s，n=6)

Tab 2 Effects of different concentrations of TSF on astrocytes volume after OGD/Reox(±s，n=6)

Tab 2 Effects of different concentrations of TSF on astrocytes volume after OGD/Reox(±s，n=6)

##P＜0.01 vs control;*P＜0.05 vs OGD/Reox

Group Control OGD/Reox Ozagrel Different concentration of TSF/mol·L－1 10 －7 10 －6 10 －5 10－4 Cell volume 5.49 ±0.44 7.63 ±0.45## 6.41 ±0.27* 7.48 ±0.34 6.80 ±0.54* 6.44 ±0.33* 6.57 ±0.73*

Tab 3 The leakage rate of LDH in astrocytes(±s，n=6)

Tab 3 The leakage rate of LDH in astrocytes(±s，n=6)

#P＜0.05，##P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs OGD/Reox

Group Leakage rate of LDH after OGD/Reox/%6 h 12 h 24 h 48 h Control 2.30 ±0.21 2.19 ±0.25 2.38 ±0.21 2.33 ±0.28 OGD/Reox 3.91 ±0.39 4.98 ±0.37# 7.21 ±0.36## 8.13 ±0.34##Ozagrel 3.13 ±0.04 3.83 ±0.19 4.72 ±0.46＊＊ 5.63 ±0.37＊＊TSF 3.06 ±0.31 3.73 ±0.31 4.89 ±0.38＊＊ 5.80 ±0.41＊＊

Fig 5 Changes of MTT in TSF group compared with OGD/Reox group(± s，n=6)

2.3 Western blot檢測 TSF對星形膠質(zhì)細胞OGD/Reox后AQP4表達的影響

2.3.1 Western blot檢測不同濃度梯度TSF對星形膠質(zhì)細胞OGD/Reox后AQP4表達的影響 星形膠質(zhì)細胞OGD/Reox后48 h，以TSF處理，與模型組相比，不同濃度梯度TSF處理組AQP4蛋白表達水平均有明顯降低(P＜0.05)，與正常組及Ozagrel組相比，差異均無顯著性(P＞0.05)。見Fig 6。

2.3.2 Western blot檢測星形膠質(zhì)細胞 OGD/Reox后各時間點AQP4的表達及TSF的影響 正常組星形膠質(zhì)細胞有一定量的AQP4蛋白表達;與正常組相比，OGD/Reox組細胞AQP4蛋白在2 h氧糖剝奪/復氧培養(yǎng)至48h時達最高值明顯高于正常組(P＜0.01);TSF處理組AQP4蛋白在2 h氧糖剝奪/復氧后的表達變化趨勢與OGD/Reox相似，但在各個時間點的表達水平均有明顯降低(P＜0.05);Ozagrel組與TSF組之間也差異無顯著性(P＞0.05)。見Fig 7。

Fig 6 Expression of AQP4 in TSF group for different concentrations via WB(±s，n=6)

Fig 7 Expression of AQP4 in TSF group compared with OGD/Reox group for different time points via WB(±s，n=6)

2.4 RT-PCR檢測TSF對星形膠質(zhì)細胞OGD/Reox后AQP4 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

2.4.1 RT-PCR檢測不同濃度梯度TSF對星形膠質(zhì)細胞OGD/Reox后AQP4 mRNA表達的影響 星形膠質(zhì)細胞OGD/Reox后48 h，與 OGD/Reox組相比，不同濃度梯度TSF處理組AQP4 mRNA表達水平均有明顯降低(P＜0.05)，與正常組及Ozagrel組相比，差異均無顯著性(P＞0.05)。見Fig 8。

Fig 8 Expression of AQP4 mRNA in TSF group compared with OGD/Reox group for different concentration via RT-PCR(±s，n=6)

2.4.2 RT-PCR檢測星形膠質(zhì)細胞OGD/Reox后各時間點AQP4 mRNA轉(zhuǎn)錄及TSF的影響 正常組星形膠質(zhì)細胞有一定量的AQP4 mRNA的表達，但表達量不隨時間的變化而變化。與正常組相比，OGD/Reox組細胞AQP4 mRNA在2 h氧糖剝奪并復氧培養(yǎng)至48 h時達最高值明顯高于正常組(P＜0.01);與OGD/Reox組相比較 Ozagrel組及 TSF處理組AQP4 mRNA在2 h氧糖剝奪并復氧后的表達也提高，但在各個時間點的表達水平均有明顯較低;Ozagrel組與TSF組之間差異也無顯著性(P＞0.05)。見Fig 9。

3 討論

腦水腫是一種過多的水分異常潴留在腦組織內(nèi)的病理過程。其存在于多種腦疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，屬于急慢性腦部疾病的重要病理過程。尤其是在腦梗死的患者中，梗死灶周圍發(fā)展出現(xiàn)水腫，形成腦水腫。目前，盡管對于腦水腫進行了大量臨床及實驗學研究，關(guān)于其具體的發(fā)生機制尚未闡明。

Fig 9 Expression of AQP4 mRNA in TSF group compared with OGD/Reox group for different time points via RT-PCR( ± s，n=6)

王婷婷等［9］在對腦缺血損傷的治療研究中發(fā)現(xiàn)，胡黃連苷Ⅱ能夠清除自由基、抗氧化，下調(diào)AQP4蛋白的表達，抑制TLR4-NF-κB信號傳導通路，從而緩解腦水腫、改善大腦的神經(jīng)功能。Arii［10］的研究表明，奧扎格雷鈉可通過減少腦梗死患者TXA2水平減少大鼠腦水腫的形成。但具體的調(diào)節(jié)機制仍未探明。徐斌等［7］進一步研究顯示，奧扎格雷鈉與巴曲酶合用通過減低MMP-9、TXA2水平保護血管內(nèi)皮，減少梗死后腦水腫以及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生。吡拉格雷鈉，是以奧扎格雷鈉為先導物進行改良的結(jié)構(gòu)新型的TXA2合成酶抑制劑，可能也是抑制TXA2的產(chǎn)生，保護血管內(nèi)皮的損傷，從而影響了星形膠質(zhì)細胞的遷移速率，改善水分子進出腦組織平衡狀態(tài)，產(chǎn)生腦水腫的治療作用。

本研究通過對星形膠質(zhì)細胞體外OGD/Reox，導致星形膠質(zhì)細胞胞體及突起明顯腫脹，建立了細胞水腫模型，以此模擬體內(nèi)星形膠質(zhì)細胞缺血/再灌注損傷引起腦水腫的病理過程［11］。實驗過程中，星形膠質(zhì)細胞在氧糖剝奪/復氧處理后，細胞逐漸腫脹，至48h時腫脹不斷明顯，LDH活性的不斷增高和MTT值得不斷降低正是星形膠質(zhì)細胞嚴重損傷的表現(xiàn)。而在OGD/Reox后加入不同濃度的TSF處理，可以使細胞的腫脹明顯減輕，LDH活性增高的程度也同樣明顯降低，表明TSF能夠明顯減輕氧糖剝奪引起的星形膠質(zhì)細胞水腫。Western blot及RTPCR的結(jié)果更分別從蛋白水平和mRNA的轉(zhuǎn)錄水平印證了這一結(jié)果。

AQP4是腦內(nèi)主要的水通道蛋白，越來越多的研究表明AQP4與腦水腫關(guān)系密切。Lopez-Rodriguez等［12］發(fā)現(xiàn)，形態(tài)和生長特征無明顯差異的AQP4基因敲除小鼠和AQP4+/+野生型小鼠的星型膠質(zhì)細胞相比，前者對水的通透性比后者低，提示AQP4是水分子快速進出的通道。Papadopoulos等［13］利用體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞建立人類在腦水腫模型的研究中發(fā)現(xiàn)，AQP4敲除小鼠的腦水腫程度明顯輕于野生小鼠。由此可見，AQP4表達水平的高低與細胞毒性腦水腫的嚴重程度直接相關(guān)。在2 h氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細胞嚴重水腫的過程中，AQP4蛋白的表達量呈上升趨勢。而在加入TSF后，氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細胞AQP4的表達水平較模型組均明顯降低，細胞水腫也明顯減輕，由此可以推測，TSF通過作用于AQP4有關(guān)蛋白阻止細胞水腫過程中胞外水分異常過多的進入細胞內(nèi)，從而達到減輕氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細胞水腫的作用。這種保護作用可能是TSF作為新型TXA2合成酶抑制劑，明顯減低了TXA2水平，從而保護血管內(nèi)皮，修復損傷內(nèi)皮細胞及對AQP4蛋白調(diào)節(jié)保護，產(chǎn)生治療細胞水腫的效果。

TSF作為TXA2合成酶抑制劑具有調(diào)節(jié)AQP4表達的作用，對于減輕氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細胞水腫作用明顯，為臨床治療顱內(nèi)瘤周腦水腫、創(chuàng)傷性腦水腫等腦水腫也提供了新的思路。最新研究表明，TSF可通過調(diào)節(jié)鈣－鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)、ERK信號通路等的活化減輕創(chuàng)傷性腦水腫［14］，但其具體分子機制研究有待于我們進一步的研究來探討。

(致謝:本實驗全部由中國藥科大學藥理學實驗室吳玉林老師課題組獨立完成，感謝我的導師吳玉林老師在實驗設計思路上提出的建議和意見及實驗技術(shù)上給予的指導。)

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