杜安妮綜述，石京山審校

（遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實驗室，貴州遵義563000）

創(chuàng)傷性腦損傷動物模型的新進(jìn)展

杜安妮綜述，石京山審校

（遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實驗室，貴州遵義563000）

腦損傷；疾病模型，動物；實驗研究

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是指由外部機(jī)械力造成腦組織損傷，導(dǎo)致暫時或永久性認(rèn)知、身體和心理功能障礙[1]。全球范圍內(nèi)每年因TBI住院或死亡患者約為1 000萬[2]。TBI不是單一的病理生理機(jī)制，而是復(fù)雜的疾病過程，其是由初級及次級損傷造成結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙。主要的損傷發(fā)生在腦組織暴露于外力時對血管和軸突的破壞，如神經(jīng)元軸突發(fā)生拉伸和撕裂。原發(fā)性腦損傷后幾分鐘至數(shù)月可演變?yōu)槔^發(fā)性腦損傷，導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡、腦組織損傷，進(jìn)而引起代謝紊亂。

在過去的幾十年中動物模型已發(fā)展到模擬人類TBI的各個方面，用于更好地了解TBI相關(guān)病理生理機(jī)制、探索有效的治療方法。然而，對動物TBI模型起效的神經(jīng)保護(hù)藥物均在Ⅱ期或Ⅲ期臨床試驗中失敗?；谂R床前研究失敗的現(xiàn)況，急需重擬TBI動物模型和治療策略。在此，本文對現(xiàn)有TBI動物模型進(jìn)行概述，以期進(jìn)一步改進(jìn)動物模型并深入認(rèn)識TBI。

1 TBI動物模型

雖然大型動物更接近于人類生理狀態(tài)，但鼠類由于成本低、體積小、便于標(biāo)準(zhǔn)化測量等優(yōu)點(diǎn)，常用于TBI的研究。其中，5個模型應(yīng)用廣泛，即液壓沖擊損傷（fluid percussion injury，F(xiàn)PI）、皮質(zhì)撞擊損傷（cortical impact injury，CCI）、重物墜落損傷、爆炸傷及輕度TBI等。

1.1 FPI TBI模型在FPI模型中損傷是由擺錘的儲層流體活塞通過開顱產(chǎn)生流體壓力脈沖完整的硬膜，損傷集中在中線或橫向頂骨的前囟和人字縫間。敲擊產(chǎn)生微小位移并使腦組織變形，損傷嚴(yán)重程度取決于脈沖壓力強(qiáng)度。根據(jù)開顱位置，F(xiàn)PI模型可分為中線（集中在矢狀縫）、矢狀竇旁（中線小于3.5 mm處）和橫向模式（lateral fluid percussion injury，LFPI，中線大于3.5 mm處）。中線FPI最初是為貓和兔子使用而研制的TBI模型，也適用于大鼠，后改為嚙齒動物L(fēng)FPI模型。FPI還用于貓、兔子、狗、羊、大鼠、小鼠[3]和豬等動物的TBI病理生理學(xué)和藥理學(xué)研究。LFPI模型是最廣泛使用的TBI動物模型之一，在大鼠中LFPI產(chǎn)生皮質(zhì)挫裂傷和彌漫性皮層下（如海馬、丘腦）神經(jīng)元損傷，其損傷12 h后發(fā)展為神經(jīng)元缺失，損傷部位下方皮質(zhì)挫傷數(shù)周后擴(kuò)大至神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并在傷后1年繼續(xù)擴(kuò)大直至細(xì)胞死亡。LFPI產(chǎn)生的認(rèn)知和神經(jīng)行為缺陷常見于TBI患者，如運(yùn)動、記憶困難等。而認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)系統(tǒng)損傷見于持續(xù)1年多的重癥LFPI。

通過大鼠的開顱手術(shù)部位確定組織損傷程度和位置，以增加該模型的可靠性和可重復(fù)性。LFPI模型主要造成單邊皮質(zhì)損傷，很少累及對側(cè)皮層和腦干，而中線、矢狀竇旁FPI模型導(dǎo)致雙側(cè)皮質(zhì)與下腦干改變，其與直接軸向運(yùn)動相關(guān)聯(lián)。FPI模型復(fù)制的臨床腦損傷無顱骨骨折。中、重度TBI患者往往與跨多個腦回的顱骨骨折和腦挫傷相關(guān)，該模型并不能反映這一特點(diǎn)。但FPI可復(fù)制顱內(nèi)出血、腦腫脹和進(jìn)行性灰質(zhì)損傷，符合人類腦損傷的病理生理特點(diǎn)。為提高FPI模型的可重復(fù)性，有學(xué)者研發(fā)了一種微處理器控制的氣動工具。在這個新的裝置中沖擊壓力和停留時間可精確控制，從而減少了實驗誤差。雖然LFPI模型已經(jīng)流行于研究TBI的神經(jīng)細(xì)胞死亡機(jī)制，但在最近的FPI模型中更應(yīng)值得注意的是彌漫性腦損傷[4]。

1.2 控制性CCI TBI模型CCI模型使用氣動或電磁沖擊裝置驅(qū)動剛性沖擊頭，破壞完整的硬腦膜，并模仿皮質(zhì)組織損傷、急性硬膜下水腫、彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）、腦震蕩、血腦脊液屏障（bloodbrain barrier，BBB）功能障礙，甚至昏迷。其已應(yīng)用在雪貂、大鼠、小鼠、豬和猴子等動物中。該模型的損傷是通過單側(cè)開顱沖擊傳遞到完整的硬腦膜最底層皮質(zhì)，往往在前囟和人字縫間引起變形。有學(xué)者對CCI模型進(jìn)行了全面的神經(jīng)病理學(xué)評估認(rèn)為，相關(guān)的損傷包括海馬和丘腦變性。與其他TBI模型比較，該模型的優(yōu)點(diǎn)在于改善了機(jī)械因素，如可以控制時間、速度和沖擊深度。因此，其比FPI模型的生物力學(xué)研究更為有效。CCI模型與涉及重力驅(qū)動設(shè)備的模型比較，減少了反彈傷害的風(fēng)險。該模型的病理嚴(yán)重程度隨著皮質(zhì)變形和沖擊速度增大，其損傷程度可根據(jù)具體實驗要求而調(diào)整。CCI產(chǎn)生的認(rèn)知缺陷持續(xù)長達(dá)1年，可能與腦萎縮和腦血流量逐漸下降相關(guān)。其中，豬CCI模型可重現(xiàn)的損傷類似于人類腦損傷的病理特征。

1.3 重物墜落損傷TBI模型在重物墜落損傷模型中實驗動物暴露顱骨，重錘以重力為引導(dǎo)自由下落。創(chuàng)傷程度由重錘質(zhì)量和高度調(diào)節(jié)，簡單實用，可行性強(qiáng)，但重復(fù)性較差。在Feeney′s（自由落體撞擊法）的重物下落實驗中重錘以自由落體方式撞擊完好的硬膜導(dǎo)致皮質(zhì)挫傷。有學(xué)者采用校準(zhǔn)的重物落體裝置致嚙齒動物閉合性顱腦損傷（closed head injury，CHI），實驗中大鼠頭放置于堅硬的平面上，重錘落下，沖擊傳遞到未受保護(hù)的顱骨正面，由此產(chǎn)生神經(jīng)功能障礙和BBB破壞。該神經(jīng)損傷與腦損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)。最近，在小鼠模型中通過磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）評估形態(tài)學(xué)變化的研究表明，神經(jīng)元變性及小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活可引發(fā)神經(jīng)行為缺陷[5]，說明該模型與人類CHI的臨床情況相似[6]。

有學(xué)者研發(fā)了沖擊加速度模型（Marmarou模型），模仿人類DAI。在該模型中將麻醉大鼠平放在泡沫平臺上，由中線切口致顱骨外露，放置不銹鋼金屬片于前囟和人字縫間的頭骨中線，創(chuàng)傷裝置從指定高度通過有機(jī)玻璃的黃銅套管自由落下至金屬片產(chǎn)生沖擊。Marmarou模型引起雙向神經(jīng)元軸突、樹突損傷及廣泛DAI，特別是在胼胝體、內(nèi)囊、視束、大腦和小腦，并通過傳導(dǎo)束傳遞至腦干。這也導(dǎo)致運(yùn)動和認(rèn)知缺陷，如行走和記憶困難，類似于FPI和CCI。該模型易于操作，并能制造出由輕至重不同程度的損傷，廣泛應(yīng)用于彌漫性腦損傷的研究。而DAI模型的缺點(diǎn)是重物下降可能導(dǎo)致可變性損傷。

以前可用的嚙齒動物CHI模型不能復(fù)制在交通意外和運(yùn)動事故中的額葉損傷。由Marmarou沖擊加速度模型修改并研究出新的CHI動物模型，以重現(xiàn)這些損傷，稱之為Maryland模型。沖擊力施加到顱骨前部，并產(chǎn)生顱骨內(nèi)大腦矢狀旋轉(zhuǎn)加速度。該動物模型的特征是不產(chǎn)生皮質(zhì)挫傷、顱骨骨折和長時間的呼吸暫停，從而降低了實驗動物致死率，但可表現(xiàn)為點(diǎn)狀出血和DAI。其神經(jīng)行為功能障礙表現(xiàn)為自發(fā)性空間探索能力降低，可持續(xù)超過1周，故該模型還需進(jìn)一步研究。

1.4 爆炸傷TBI模型爆炸傷多由爆炸沖擊波造成，為闡明沖擊波對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，爆炸傷TBI的各種動物模型已建立，主要應(yīng)用于嚙齒類動物[7-8]和豬[9]。使用壓縮氣體驅(qū)動激波管模擬爆炸效果，評估生理、病理及神經(jīng)行為，同時，計算模型動物急性致死率。結(jié)果表明，激波管生成的爆炸傷導(dǎo)致部分TBI大鼠發(fā)生低血壓或低氧血癥，這可能與爆炸引起的肺損傷及出血有關(guān)。Reneer等[10]模擬了輕微爆炸傷TBI大鼠模型。非打擊式爆炸傷，其特征是彌漫性腦水腫和延遲性腦血管痙攣，DAI出現(xiàn)于最初2周[11]。Kuehn等[12]發(fā)現(xiàn)，頭部暴露于嚴(yán)重爆炸沖擊波容易使人產(chǎn)生顯著神經(jīng)功能障礙，并導(dǎo)致認(rèn)知缺陷。有研究表明，爆炸傷導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)TAU蛋白磷酸化、髓鞘軸突病變、微血管病變、慢性神經(jīng)炎癥和組織損傷。但應(yīng)注意的是，動物距離激波管的放置（即內(nèi)、外側(cè)或出口附近）決定了損傷嚴(yán)重程度和致死率[13]。大多數(shù)可用的爆炸傷模型側(cè)重于組織的破壞而非功能缺損[14]。即使是輕微的爆炸致腦損傷也會引起小鼠長期的行為和運(yùn)動異常，其中包括空間記憶障礙、運(yùn)動協(xié)調(diào)受損和行為缺陷[15]。因此，進(jìn)一步設(shè)計相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的爆炸傷TBI模型是闡明爆炸致腦損傷機(jī)制的重點(diǎn)。

1.5 輕度TBI模型美國每年有170多萬例輕度TBI[16]，其通常發(fā)生于接觸性運(yùn)動，如拳擊、曲棍球、足球等。有研究表明，反復(fù)腦震蕩會造成累積性長期行為障礙和神經(jīng)病理學(xué)改變[16-17]。Kane等[18]修改了Marmarou沖擊加速度模型，重復(fù)沖擊輕度麻醉的小鼠頭部。該法無需頭皮切口，小鼠幾乎不會出現(xiàn)癲癇和癱瘓癥狀，而出現(xiàn)顱骨骨折和顱內(nèi)出血也十分罕見；運(yùn)動協(xié)調(diào)和功能輕微缺陷，一段時間后可自行恢復(fù)。小部分星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和磷酸化TAU蛋白水平增加不會破壞BBB、誘發(fā)水腫和激活小膠質(zhì)細(xì)胞。這種新的動物模型適用于輕度腦震蕩的新藥篩選治療。大鼠單一的LFPI誘導(dǎo)其產(chǎn)生短期的行為和病理變化[19]，而反復(fù)的輕度LFPI導(dǎo)致長期累積的行為障礙、神經(jīng)炎癥和皮質(zhì)神經(jīng)元缺損[20]。在沒有行為障礙的TBI大鼠模型中輕度腦震蕩會引起急性神經(jīng)炎癥[21]。對動物模型的研究表明，輕度TBI短期內(nèi)具有致命性，且與反復(fù)腦震蕩患者的研究結(jié)果一致。這些模型為進(jìn)一步觀察輕度TBI提供了依據(jù)。

2 動物模型的局限性

2.1 生理差異的局限性在大腦結(jié)構(gòu)和功能上非人類哺乳動物（特別是嚙齒動物）與人類大腦存在顯著差異，包括大腦幾何形狀、腦脊髓組成、腦回復(fù)雜性及白灰質(zhì)比等。這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可能會導(dǎo)致創(chuàng)傷在不同物種間所造成的反應(yīng)、嚴(yán)重程度或類型各不相同。

TBI后的動物和人類均在性別上存在較大差異，女性較男性腦損傷后并發(fā)癥發(fā)生率較低。動物實驗研究表明，雌性激素可能具有神經(jīng)保護(hù)作用[22]。目前的臨床治療也證明雌、孕激素可促進(jìn)TBI患者神經(jīng)功能的恢復(fù)。除性激素外，男、女之間存在諸多差別，如對腦功能和代謝產(chǎn)生的影響。由于大多數(shù)TBI模型均使用雄性動物進(jìn)行研究，并不涉及雌性動物，因此，針對TBI及其治療的性別差異研究顯得尤為重要。許多研究TBI模型者不嚴(yán)格計算包括二氧化碳分壓、氧分壓、pH值、血壓和大腦溫度等生理參數(shù)，而這些參數(shù)對確定病理生理反應(yīng)、損傷和治療是非常重要的。事實上，這正是TBI研究領(lǐng)域的缺陷之一，故應(yīng)加強(qiáng)對這些參數(shù)在急性和長期實驗中的檢測。

2.2 長期與短期實驗的局限性迄今為止，大多數(shù)TBI動物模型的研究主要集中于短期存活時間上，很少延伸超過1個月。在早期損傷后組織學(xué)和行為學(xué)結(jié)果無法為長期實驗提供有效支撐，不能用于評價臨床治療的長期療效。要驗證早期變化是否可預(yù)測長期結(jié)果，研究長期（傷后3個月至1年）損傷的反應(yīng)和功能障礙是必要的。一些研究表明，長期功能和結(jié)構(gòu)變化發(fā)生在傷后1年，治療窗不限于TBI后的前幾個小時，并可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過該時期。延誤治療可能會錯過TBI患者早期的神經(jīng)保護(hù)治療窗，如在TBI發(fā)生24 h后[23]，神經(jīng)修復(fù)的延遲治療也可改善其功能恢復(fù)。

在TBI的嚙齒類動物模型中檢測長期行為缺陷，認(rèn)知缺陷較感覺缺陷更為明顯和持久，大鼠認(rèn)知缺陷觀察結(jié)果與人類TBI后遺癥基本一致。由于新穎的治療方法可限于特定類型的損傷，甚至特定的行為缺陷，所以，利用不同種類TBI的嚙齒動物模型和長期的行為測試結(jié)果可為未來臨床前研究提供可靠依據(jù)。

2.3 評估損傷程度的局限性損傷嚴(yán)重程度評估是TBI診斷、治療和預(yù)后的關(guān)鍵。目前，在腦損傷的臨床治療中格拉斯哥昏迷評分（glasgow coma scale，GCS）和格拉斯哥預(yù)后評分（glasgow outcome scale，GOS）是評估患者損傷程度的主要方法[24]。雖可通過在CHI 1 h后測定小鼠和大鼠神經(jīng)系統(tǒng)評分（neurological severity score，NSS）來判斷其損傷嚴(yán)重程度，但現(xiàn)有的動物實驗中一直缺乏對損傷嚴(yán)重性的通用評分系統(tǒng)。然而，機(jī)械性損傷參數(shù)、組織學(xué)變化和功能測試是實驗性TBI分為輕、中、重度水平的可靠測量依據(jù)。此外，開顱手術(shù)位置的微小移動會產(chǎn)生認(rèn)知功能的差異、海馬細(xì)胞損傷和活化星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。輕度TBI與重度TBI比較，創(chuàng)傷后遺癥無明顯形態(tài)學(xué)改變且致死率較低，但仍缺乏全面研究的動物模型。

先進(jìn)的MRI檢查可檢測TBI動物模型和輕度TBI患者大腦活動和形態(tài)學(xué)的微妙變化[25]。盡管影像學(xué)診斷快速發(fā)展，但TBI的早期評估、長期結(jié)果預(yù)測和嚴(yán)重程度判斷仍有困難。需要更多學(xué)者致力于尋找敏感、可靠的TBI生物學(xué)標(biāo)志物，并使TBI動物模型中的生物學(xué)標(biāo)志物能真實、準(zhǔn)確地反映在人類腦損傷中。

3 結(jié)論

臨床上缺乏有效的TBI治療藥物是神經(jīng)學(xué)研究領(lǐng)域與制藥業(yè)的一個重大難題。加深對TBI模型的認(rèn)知、深入了解創(chuàng)傷后遺反應(yīng)、研究各種動物模型和體外實驗是當(dāng)前的首要任務(wù)。動物模型可用于探索復(fù)雜的病理生理機(jī)制，測試新的治療藥物，并確保臨床試驗的安全性。已研制的各種TBI嚙齒類動物模型與人類腦損傷機(jī)制相似。小動物模型已用于TBI基本機(jī)制和病理結(jié)果的研究，但由于道德倫理和花費(fèi)巨大等原因，研究人員很少使用TBI大動物模型監(jiān)測其臨床相關(guān)的生理參數(shù)、長期功能、認(rèn)知結(jié)果和測試新的治療方法的功效。因此，在臨床試驗時應(yīng)在嚙齒類動物中首先進(jìn)行測試，證實其功效，再在高度模仿腦損傷的大動物模型中研究其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制。落體打擊模型可用于彌漫性和局灶性腦損傷的研究，LFPI和CCI是最廣泛使用的嚙齒類動物腦損傷模型?，F(xiàn)今，越來越多的研究集中在爆炸傷和輕度TBI模型方面。

臨床研究設(shè)計無法復(fù)制腦損傷治療過程中的每個環(huán)節(jié)，如早期低溫治療有益于許多腦損傷的實驗?zāi)Ｐ停挥性赥BI患者開顱手術(shù)1.5 h內(nèi)應(yīng)用低溫治療才可改善其血腫清除，但不能改善患者的彌漫性腦損傷病變[26]。這意味著對特定TBI患者聯(lián)合治療的最佳時機(jī)把握至關(guān)重要。

總之，目前的動物模型不能模仿所有類型的人類腦損傷。為實現(xiàn)TBI治療上的突破仍需采取多種辦法。首先，在臨床試驗設(shè)計上結(jié)合臨床，開發(fā)相關(guān)的創(chuàng)新模型，對已建立的模型進(jìn)行改進(jìn)和功能測試；并尋找高特異性和高敏感度的生物學(xué)標(biāo)志物，優(yōu)化聯(lián)合治療劑量和給藥時間。其次，研究TBI不同年齡、性別和品種對結(jié)果的影響。最后，大多數(shù)藥物在測試期限內(nèi)不能透過BBB，有效地治療腦損傷。因此，在研究過程中更應(yīng)關(guān)注藥物釋放系統(tǒng)、監(jiān)控目標(biāo)藥物濃度及藥物相互作用。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.04.016

：A

：1009-5519（2015）04-0526-04

2014-10-29）

貴州省科技廳資助項目（[2006]5041）。

杜安妮（1990-），女，山東莒縣人，碩士研究生，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)的研究；E-mail：57568358@qq.com。

石京山（E-mail：shijs@zmc.edu.cn）。