周怡 方強(qiáng) 陳志文 季惠翔 潘進(jìn)洪

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院·全軍泌尿外科研究所，重慶 400038)

熒光原位雜交技術(shù)在尿路上皮腫瘤診斷中的臨床應(yīng)用*

周怡 方強(qiáng) 陳志文 季惠翔 潘進(jìn)洪

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院·全軍泌尿外科研究所，重慶 400038)

目的 探討通過熒光原位雜交檢測(cè)3、7和17號(hào)染色體及p16位點(diǎn)異常在預(yù)測(cè)尿路上皮腫瘤的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 收集尿路上皮腫瘤患者和健康成人作正常對(duì)照組尿液，同時(shí)行尿脫落細(xì)胞學(xué)及FISH檢測(cè)3、7、17號(hào)染色體及p16位點(diǎn)異常。采用正常對(duì)照組各染色體異常數(shù)據(jù)設(shè)定閾值用于腫瘤患者的實(shí)驗(yàn)室診斷。分別計(jì)算FISH和尿脫落細(xì)胞對(duì)尿路上皮腫瘤診斷的敏感度和特異度。分析各染色體畸變與尿路上皮腫瘤病理分級(jí)的關(guān)系。結(jié)果 ①尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的腫瘤陽性檢出率為11.5%，F(xiàn)ISH為97.1%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) ②各染色體及區(qū)帶均呈現(xiàn)較高的畸變發(fā)生率，其中多體畸變發(fā)生率由高到低依次為82.6%(7號(hào))、71.7%(17號(hào))、 66.6%(3號(hào))和49.2%( p16位點(diǎn))，單體畸變發(fā)生率由高到低依次為53.6%(p16位點(diǎn))、 36.9%(7號(hào))、34.7%(3號(hào)) 和28.9%(17號(hào))，單體缺失畸變p16位點(diǎn)17.3%。③7號(hào)染色體的多體畸變與腫瘤的病理分級(jí)間呈正相關(guān)(r=18.632,P<0.001), 其余三種染色體畸變與腫瘤的病理分級(jí)無相關(guān)性。結(jié)論 對(duì)尿路上皮腫瘤患者進(jìn)行FISH檢側(cè)是一種無創(chuàng)、有效的檢測(cè)方法。尿路上皮腫瘤在3、7 和17 號(hào)染色體及p16位點(diǎn)同時(shí)存在多種畸變類型，7號(hào)染色體多體畸變可預(yù)測(cè)尿路上皮腫瘤的進(jìn)展。

熒光原位雜交； 尿路上皮腫瘤； 染色體畸變

尿路上皮腫瘤包括腎盂癌、輸尿管癌、膀胱癌以及尿道上皮癌, 以膀胱癌最為常見。膀胱癌是全世界第五大常見癌癥之一，其發(fā)病率且復(fù)發(fā)率高，早期診斷對(duì)于提高患者生存率有著非常重要意義[1]。常規(guī)的診斷方法為尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查和膀胱鏡、輸尿管鏡檢查，前者的敏感性較低，而后者為有創(chuàng)檢查，增加患者痛苦。近年來，通過熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術(shù)檢測(cè)尿液中脫落細(xì)胞染色體異常從而早期診斷膀胱癌已成為熱點(diǎn)，Skacel等[2]研究顯示FISH在膀胱癌的診斷中有較高的敏感性，且為無創(chuàng)檢查。本研究采用FISH技術(shù)檢測(cè)3、7、17號(hào)染色體及p16區(qū)帶位點(diǎn)的畸變情況，并對(duì)尿路上皮腫瘤的分級(jí)分期進(jìn)行相關(guān)研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年10月至2014年4月我科收治的尿路上皮腫瘤的患者共138例，其中膀胱尿路上皮癌111例、腎盂尿路上皮癌17例、輸尿管尿路上皮癌6例、低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤2例、腎盂癌并發(fā)輸尿管癌2例。男性100例, 女性38例，年齡31～87歲，平均62.3歲。按2004WHO腫瘤病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分類，低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤2例，低分級(jí)尿路上皮乳頭狀癌44例，高分級(jí)尿路上皮乳頭狀癌92例。所有患者均行尿FISH檢測(cè)、尿脫細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、腹部超聲、泌尿系CT或膀胱鏡、輸尿管鏡檢查。同時(shí)設(shè)對(duì)照組20例，男性15例，女性5例，計(jì)算FISH檢測(cè)閾值。

1.2 儀器和試劑 熒光原位雜交操作平臺(tái)(OLYMPUS BX51系統(tǒng)顯微鏡，OLYMPUS BX-UCB通道轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，熒光燈，DELL微型計(jì)算機(jī)，Progres Capture Pro2.5攝像系統(tǒng),VIDEOTEST-FISH2.0 圖像分析處理系統(tǒng)),水浴鍋和電熱恒溫培養(yǎng)箱，離心機(jī)，烤片機(jī)，試劑盒-探針來自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，分為兩組CSP3/CSP7 綠色/ 紅色)和GLP16/CSP17(紅色/綠色)。

1.3 FISH檢測(cè)技術(shù) 將預(yù)先收集的晨尿50～100ml，離心10min,1500 r/ min, 去上清，加膠原酶消化，37℃ 消化20 min。 1500 r/ min 離心10 min, 去上清, 加5 ml 預(yù)熱的0.075 mol/ L KCl 低滲溶液,37℃ 低滲15 min，固定：加2 ml 固定液( 甲醇∶冰醋酸3∶1), 混勻, 1500 r/ min離心10 min, 去上清；加入5 ml 固定液，1500r/ min 離心10 min,重復(fù)固定1 次， 離心去上清后滴片，56℃中老化玻片60min。玻片處理：將玻片置于2×SSC中漂洗2次，每次5 min，玻片再置于預(yù)熱胃蛋白酶粉中浸泡5 min，再次放入于2×SSC中漂洗2次，每次5 min，最后依次置于70% 、85% 、100% 乙醇中脫水每次3 min。變性雜交：暗處：將玻片在變性液中浸泡5 min，梯度脫水。玻片自然干燥后, 試劑滴在雜交區(qū)域，封片置于預(yù)熱的濕盒中, 42℃恒溫箱中過夜。雜交后洗滌：移去蓋玻片,甲酰胺/ 2×SSC 溶液洗滌玻片,每次10 min，置于2×SSC、2×SSC、NP-40溶液中，每次5 min。梯度脫水后暗處干燥。加DAPI于雜交區(qū)域復(fù)染，10 min后觀察結(jié)果。

1.4 FISH閾值建立 FISH閾值來自20例健康成人尿液，F(xiàn)ISH檢測(cè)結(jié)果，具體方法如下：每例樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)細(xì)胞至少100個(gè)，3號(hào)、7號(hào)及17號(hào)染色體各需要建立兩個(gè)閾值(1個(gè)信號(hào)點(diǎn)，大于和等于3個(gè)信號(hào)點(diǎn))，P16需要建立3個(gè)閾值(0個(gè)信號(hào)點(diǎn)，1個(gè)信號(hào)點(diǎn)，大于和等于3個(gè)信號(hào)點(diǎn))。以公式 “閾值=平均值 + 3×標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”。

1.5 FISH結(jié)果及判斷 熒光顯微鏡下觀察，選擇雜交信號(hào)均勻的區(qū)域，分析大的、不典型的、細(xì)胞核不規(guī)則的細(xì)胞，細(xì)胞重疊、破損、未去除細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核不計(jì)數(shù)，微弱雜交信號(hào)不計(jì)數(shù)。上下調(diào)節(jié)焦距，以免遺失信號(hào)，細(xì)胞內(nèi)雜交信號(hào)互相靠近且兩雜交信號(hào)之間距離小于1個(gè)雜交點(diǎn)大小者計(jì)為1個(gè)信號(hào)。記錄信號(hào)類型即每個(gè)細(xì)胞核中紅綠信號(hào)點(diǎn)的個(gè)數(shù)，正常細(xì)胞的CSP3、CSP7、CSP17著絲粒探針及GLPp16位點(diǎn)探針均表現(xiàn)為二倍體，即細(xì)胞核分別可以看到2紅2綠為正常信號(hào)，見圖1。

圖1 正常成人尿液樣本FISH檢測(cè)結(jié)果

Figure 1 FISH detection of CSP3,CSP7,GLP16 and CSP17 in the urine samples of healthy adult

注：圖A CSP3為綠色熒光、CSP7為紅色熒光，圖BGLP16為紅色熒光、CSP17為綠色熒光

陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn): 記錄信號(hào)類型即每個(gè)細(xì)胞核中紅綠信號(hào)點(diǎn)的個(gè)數(shù)，每例標(biāo)本每種探針分析100個(gè)細(xì)胞核。見圖2。CSP3為綠色/CSP7為紅色可見3、

圖2 尿路上皮腫瘤患者尿液樣本FISH檢測(cè)信號(hào)圖

Figure 2 FISH detection of CSP3,CSP7,GLP16 and CSP17 in the urine samples of urothelial cancer patient

注：圖A CSP3為綠色熒光、CSP7為紅色熒光，圖BGLP16為紅色熒光、CSP17為綠色熒光

CSP3/CSP7號(hào)染色體組雜交后信號(hào)點(diǎn)熒光信號(hào)為綠色/紅色，可見3號(hào)、7號(hào)染色體擴(kuò)增。GLP16/CSP17均表現(xiàn)為紅色/綠色，可見P16位點(diǎn)缺失、17號(hào)染色體擴(kuò)增。

7號(hào)染色體有不同程度擴(kuò)增均多于2個(gè)信號(hào)點(diǎn)，GLPp16為紅色/CSP17為綠色，17號(hào)染色體不同程度擴(kuò)增多于2個(gè)信號(hào)點(diǎn)，P16基因缺失1個(gè)或0個(gè)信號(hào)點(diǎn)。①任意兩個(gè)以上位點(diǎn)(含兩個(gè))出現(xiàn)異常，如3號(hào)和7號(hào)染色體出現(xiàn)非整倍增加，可判斷為陽性。②一個(gè)位點(diǎn)有兩種以上(含兩種)異常，如P16有0個(gè)信號(hào)點(diǎn)和3個(gè)信號(hào)點(diǎn)異常，可判斷為陽性。③若只有一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)異常，擴(kuò)大計(jì)數(shù)細(xì)胞后再重新判斷。

1.6 尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查 標(biāo)本采集(留取尿液)-涂片固定-HE染色-鏡檢-結(jié)果(陽性或陰性)。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)由兩位固定的高年資病理科醫(yī)師進(jìn)行診斷。

1.7 病理結(jié)果 取患者活檢或術(shù)后組織標(biāo)本行常規(guī)病理檢查，由兩名以上專業(yè)的病理醫(yī)師共同閱片診斷。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，采用spearman分析各染色體畸變檢出率與臨床病理分級(jí)、分期之間的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 閾值結(jié)果 各染色體畸變的臨界值稱之為閾值。正常成人尿液樣本FISH檢測(cè)閾值，見表1。

2.2 FISH與尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查腫瘤陽性檢出率比較 138例尿路上皮癌患者中，F(xiàn)ISH檢測(cè)結(jié)果陽性者為134例，陰性者為4例。得出FISH靈敏度為97.1%(134/138)，特異度為100%。尿脫落細(xì)胞學(xué)結(jié)果中僅有6例尿液中發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，靈敏度為11.5%(16/138)，特異度為100%。FISH 檢測(cè)膀胱尿路上皮癌的靈敏度高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查(P<0.01)，而兩者的特異度差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 FISH檢測(cè)結(jié)果及各染色體畸變率分析 根據(jù)建立閾值，判斷各染色體及區(qū)帶畸變發(fā)生率。多體畸變發(fā)生率由高到低依次為82.6%(7號(hào))、71.7%(17號(hào))、66.6%(3號(hào))和49.2%(p16位點(diǎn))。單體畸變發(fā)生率由高到低依次為53.6% (p16位點(diǎn))、36.9%(7號(hào)) 、34.7% (3號(hào))和28.9% (17號(hào))。單體缺失畸變p16位點(diǎn)17.3%。

2.4 各染色體畸變與腫瘤病理分級(jí)的關(guān)系 在138例患者中病理結(jié)果證實(shí)為尿路上皮腫瘤，按照2004年WHO腫瘤病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤2例，低分級(jí)尿路上皮乳頭狀癌44例，高分級(jí)尿路上皮乳頭狀癌92例。本組資料顯示，僅7號(hào)染色體的多體畸變與腫瘤的病理分級(jí)間呈正相關(guān)(r=18.632,P<0.001)，其余三種染色體及區(qū)帶不同類型的畸變情況均未顯示出與病理分級(jí)間無相關(guān)性，見表2。

表1 正常成人尿液樣本 FISH 檢測(cè)閾值

注: CSP3、CSP7、CSP17 分別表示3、7 和17 號(hào)染色體著絲粒熒光探針, GLP16 表示9p21位點(diǎn)特異性熒光探針。

表3 CSP3、CSP7、GLP16和CSP17染色體畸變與腫瘤病理分級(jí)的關(guān)系

注：PUNLMP(低度惡性潛能尿路上皮乳頭狀瘤)、LGPUC(低分級(jí)尿路上皮乳頭狀癌)、LGPUC(高分級(jí)尿路上皮乳頭狀癌)

3 討論

FISH是應(yīng)用已知熒光染料單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)原則，與待檢標(biāo)本中核酸特異性結(jié)合，形成可被測(cè)的雜交雙鏈核酸。從而對(duì)待檢標(biāo)本在熒光顯微鏡下進(jìn)行染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常分析。自2000年Sokolova等[3]建立首個(gè)膀胱尿路上皮癌FISH探針以來，目前基本確立將3、7、17號(hào)染色體及9號(hào)染色體P16位點(diǎn)探針作為常規(guī)檢測(cè)目標(biāo)，結(jié)果顯示FISH的敏感性高達(dá)74.68%，這對(duì)于尿路上皮癌的早期診斷十分重要。本研究對(duì)138例尿路上皮腫瘤患者的尿液脫落細(xì)胞和FISH檢測(cè)顯示，兩種方法特異度均為100%，但FISH的靈敏度(97.1%)明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查(11..5%)。由此，F(xiàn)ISH在尿路上皮腫瘤的診斷中優(yōu)于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

2001年7月被FDA批準(zhǔn)用于膀胱腫瘤的檢測(cè)，其主要研究染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變。Sandberg 等[4]在1994年對(duì)泌尿腫瘤染色體研究認(rèn)為，尿路上皮癌易發(fā)生染色體改變，其中包括結(jié)構(gòu)畸變和染色體數(shù)目異常，常見結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w有3、9、1、5、11、21、17 號(hào)染色體，染色體數(shù)異常見于3、9、7、10、11、Y、1、8、17、15 號(hào)染色體。目前臨床上用于診斷尿路上皮癌的常用染色體主要有: 3、7、9、17 號(hào)染色體。3號(hào)染色體多倍體表達(dá)與膀胱尿路上皮癌的病達(dá)76.00%,定位于3p25的RAFI基因過理分級(jí)相關(guān)[5,6]。7號(hào)染色體多倍體發(fā)生率大約為76.20%[7]。其多倍體與病理分期、分級(jí)顯著相關(guān), 7號(hào)染色體畸變可能在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[8]。

尿路上皮癌，尤其是膀胱尿路上皮癌的發(fā)病率在人群中可高達(dá)0.1%，其中約70%為非肌層浸潤(rùn)性腫瘤，30%為肌層浸潤(rùn)性膀胱腫瘤，有報(bào)道[9]稱Ta、Tis、T1期腫瘤進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)的比率分別為5%、54%和46%。此外腫瘤的分級(jí)也與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，G1、G2、G3 腫瘤進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)的比率分別為2%、11%和45%[10]。因此，淺表性膀胱癌患者需術(shù)后隨訪以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)。

4 結(jié)論

FISH技術(shù)具有敏感度高、特異性強(qiáng)、無創(chuàng)性等優(yōu)點(diǎn)，在尿路上皮腫瘤早期診斷及術(shù)后監(jiān)測(cè)中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。尤其在各染色體及區(qū)帶畸變發(fā)生率中，以多體畸變?yōu)橹?。此外?號(hào)染色體的多體畸變與尿路上皮腫瘤的病理分級(jí)間呈正相關(guān)，有望成為尿路上皮腫瘤進(jìn)展和侵襲的標(biāo)記物。

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Application of fluorescence in situ hybridization technique in diagnosis of urothelial tumor

ZHOU Yi，F(xiàn)ANG Qiang，CHEN Zhi-wen，etal

(InstituteofUrinarySurgery,SouthwestHospital,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Objective To investigate the role of fluorescence in situ hybridization technician in the diagnosis of urothelial tumors.Methods FISH diagnostic threshold was established by 20 cases of healthy adults. 138 cases of urothelial cancer patients were performed urine cytology and FISH detection of chromosome 3, 7 and 17 and abnormal p16 locus, the diagnostic value of two methods and the relationships between chromosomal aberrations and pathological grade were analyzed. Results The sensitivity of Urine cytology and FISH was 11.5% and 97.1% respectively, the difference was statistically significant (P<0.01). Each chromosome and zone showed a higher incidence of distortion. The incidence of multiple aberrations were 82.6% (7), (17) 71.7%, 66.6% (3) and 49.2% (p16). The incidence of monomer distortion were 53.6% (p16), 36.9% (7), 34.7% (3) and 28.9% (17). The incidence of p16 locus monomer distortion rate was 17.3%. The 7th chromosome multi-body aberrations was positively correlated with tumor pathological grade (r=18.632,P<0.001). Conclusion FISH is a noninvasive and effective detection method for urothelial tumors. The multi-body aberration of 7th chromosome is predictable for progress of urothelial tumors.

Fluorescence in situ hybridization; Urothelial tumors; Chromosome aberration

國(guó)家自然科學(xué)基金(81172441)

方強(qiáng)，E-mail:fangqiang@tmmu.edu.cn

R 737.15

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.008

2014-11-03； 編輯： 張文秀)