王慧娟 馮社軍 武艷強 李軍濤

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

大黃素通過抑制p38 MAPK活化下調H2O2誘導PC12細胞COX-2表達的實驗研究*

王慧娟 馮社軍 武艷強 李軍濤

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的 探討大黃素能否通過抑制p38 MAPK活化下調H2O2誘導的PC12細胞COX-2表達。方法 將神經元PC12細胞分為3組：對照組(Control組)、大黃素+H2O2組 (Emodin+H2O2組)和H2O2組。在300μM的H2O2干預4小時后使用RT-PCR法和western blot法對各組PC 12細胞COX-2 mRNA和蛋白的表達水平進行檢測；并使用western blot法對PC12細胞p38 MAPK磷酸化水平(Phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值)進行測量。結果 與對照組相比較，在300μM的H2O2干預4小時后PC12細胞COX-2 mRNA和蛋白的表達水平以及p38 MAPK磷酸化水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；但H2O2組較Emodin+H2O2組COX-2 mRNA和蛋白的表達的升高以及p38 MAPK磷酸化水平的增加更加顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。結論 大黃素可以有效抑制H2O2誘導的PC12細胞COX-2表達，并與下調p38 MAPK活化水平密切相關。

大黃素； PC12細胞； 過氧化氫； 環(huán)氧化酶-2； p38 MAPK

神經元保護即減輕神經元損傷和挽救受損的神經元是腦卒中(stroke)治療的關鍵和重點[1-4]。腦卒中時神經組織血流灌注障礙組織缺血缺氧直接和間接導致的嚴重氧化應激(oxidative stress)和炎癥反應(inflammation)是造成神經元損傷和死亡的重要原因[1-4]。研究證實減輕氧化應激和炎癥反應可有效減少神經元的死亡，并對腦卒中患者預后有重要價值[5-8]。大黃素(emodin)是中草藥大黃(rhubarb)最主要的藥理成分之一。目前研究發(fā)現(xiàn)大黃素對多種致炎因子誘導的炎癥反應有顯著的抑制作用，并認為該作用與抑制p38 MAPK的磷酸化密切相關[9, 10]。本研究的目的是探討大黃素能否通過抑制p38 MAPK活化下調H2O2誘導的PC12細胞COX-2的表達。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 大鼠嗜鉻瘤PC12細胞株從中國科學院上海細胞庫購買；大黃素(純度>98%)購買于西安崇信天然添加劑有限公司；總RNA抽提試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購自日本Takara公司；兔抗鼠COX-2抗體、兔抗鼠phospho-p38 MAPK抗體、兔抗鼠p38 MAPK和兔抗鼠β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司。DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純，美國Tedia公司)，DMSO (二甲基亞砜，國藥集團化學試劑有限公司)。其余試劑均為分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) PC12細胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清，100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5 % CO2，孵箱內培養(yǎng)。每72h換液、傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。PC12細胞分為對照組(Control組)、大黃素+H2O2組(Emodin+H2O2組)和H2O2組，共3組。其中對照組細胞加入PBS；H2O2組和大黃素+H2O2組加入H2O2(300μM)；大黃素+H2O2組加入50mM的大黃素進行干預。

1.3 細胞COX-2 mRNA表達檢測 干預4h后，按照RT-PCR試劑盒說明書提取細胞總RNA。引物：COX-2正義5′- TTCCAACCCATGTCAAAACCG-3′，反義5′-GTCAACACGTATCTCATGGAT-3′和β-actin正義：5′- ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′，反義：5′- GCCGCTGGGGAAGATGTGCT-3′。按照試劑盒說明書介紹進行反轉錄和擴增實驗。應用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quantity One軟件對目的條帶進行掃描分析。用與β-actin PCR產物條帶灰度比值作為COX-2 mRNA的相對表達量。

1.4 Western blot法檢測細胞中COX-2、phospho-p38 MAPK和total p38 MAPK蛋白表達 按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入兔抗鼠COX-2抗體 (1∶1000)、兔抗鼠phospho-p38 MAPK抗體(1∶900)、兔抗鼠p38 MAPK抗體(1∶900)和兔抗鼠β-actin 抗體(1∶1500)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。使用COX-2/β-actin和Phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK顯影強度比值進行蛋白表達量分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 計量資料以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 COX-2 mRNA和蛋白的表達 在干預4h后，對PC12細胞COX-2 mRNA和蛋白的表達水平使用RT-PCR法和western blot法進行分析。發(fā)現(xiàn)與對照組相比較，PC12細胞在H2O2刺激后COX-2 mRNA和蛋白的表達水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。但H2O2組較大黃素+H2O2組COX-2 mRNA和蛋白的表達增加更加明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<005)，見圖1和表1。

圖1 PC12細胞COX-2表達的RT-PCR和western blot結果

Figure 1 The RT-PCR and western blot results of COX-2 in PC12 cells

Table1 The mRNA and protein expression of COX-2, and the activation of p38 MAPK in PC12 cells

組別COX-2mRNACOX-2蛋白Phospho-p38MAPK/totalp38MAPKControl組0.24±0.050.19±0.040.16±0.05Emodin+H2O2組0.67±0.18①②0.71±0.13①②0.42±0.09①②H2O2組0.93±0.07①0.95±0.08①0.91±0.06①

注：①與Control組相比較P<0.05；②與H2O2組相比較P<0.05。

2.2 p38 MAPK的活化水平 在H2O2干預4h后，使用western blot法對PC12細胞p38 MAPK活化水平即p38 MAPK磷酸化水平(Phospho-p38 MAPK / total p38 MAPK比值)檢測。我們發(fā)現(xiàn)與Control組相比較，PC12細胞在H2O2干預后phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但H2O2組較Emodin+ H2O2組phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值升高更加顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2和表1。

圖2 PC12細胞p38 MAPK活化的western blot結果

Figure 2 The western blot results of the activation of p38 MAPK in PC12 cells

3 討論

腦卒中(stroke)是一種致死致殘率極高的嚴重疾病，隨著社會老齡化現(xiàn)象的逐漸加劇，腦卒中的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢。腦卒中一般可分為由血栓栓塞和動脈粥樣硬化等導致的缺血性腦卒中(ischemic stroke)以及如嚴重高血壓和血管發(fā)育畸形等所致腦血管破裂引起的出血性腦卒中(hemorrhagic stroke)兩大類[3, 4, 11]。但二者均有相似的病理生理特點和臨床特征。大量基礎和臨床研究均發(fā)現(xiàn)炎癥反應(inflammation)和氧化應激(oxidative stress)與腦卒中導致的神經元減少(包括壞死、凋亡和自噬等)密切相關，減輕和抑制炎癥反應及氧化應激對神經元有保護作用[13, 14]。

大黃作為中國常用中草藥，具有廣泛的藥用價值，中醫(yī)認為大黃具有"攻下積滯、清熱解毒、瀉火涼血及活血化瘀"等作用。目前臨床多用于急性胰腺炎、腎小球腎炎、急性腎功能衰竭和急性膽囊炎等炎癥相關性疾病的治療。大黃素(emodin)是中草藥大黃(rhubarb)最主要的藥理成分之一。目前研究認為大黃素具有較為廣泛的抑制炎癥反應的藥理作用[9, 10]。秦建華等人發(fā)現(xiàn)大黃素可以有效抑制致炎因子IL-1β誘導的大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)轉分化效應，并具有潛在的抑制腎臟炎癥反應作用[9]。王青等人的研究表明在人結腸癌HT-29細胞中大黃素對內毒素(LPS)誘導的IL-8表達有明顯的抑制作用[10]。環(huán)氧酶(cyclo-oxygen-ase, COX) 是前列腺素(PGs)合成初始步驟中的關鍵性限速酶，包括COX-1 和COX-2兩種同工酶[14]。COX-1在生理狀態(tài)下具有有保護胃腸黏膜、激活血小板及維持腎、和心腦血流灌注功能等的作用，并參與巨噬細胞的分化。COX-2 具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性，研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應和氧化應激等病理狀態(tài)時COX-2表達明顯增加，使下游的PGE2、PGH2和VEGF等炎癥介質表達增加，同時間接誘導氧自由基、脂氧化產物和活性氧等氧化應激相關物質的生成促進細胞損傷[15, 16]。同時研究還發(fā)現(xiàn)COX-2與細胞凋亡關系密切[15, 16]。研究證實COX-2在腦卒中相關的炎癥反應和氧化應激反應中扮演著重要的角色，下調COX-2的表達可有效抑制神經元的損傷和死亡[15, 16]。在本實驗中我們使用H2O2對神經元PC12細胞進行干預。在干預4小時后，PC12細胞COX-2 mRNA和蛋白的表達明顯增加，但大黃素干預的PC12細胞較未干預細胞COX-2表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。該結果表明在PC12細胞中大黃素對H2O2誘導的COX-2表達有顯著抑制作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)大黃素的抗炎癥和抗氧化應激作用與抑制p38 MAPK的磷酸化密切相關[17, 18]。p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶信號轉導通路中的關鍵蛋白，對包括COX-2、TNF-α、ICMA-1和IL-8等炎癥蛋白和介質的表達具有轉錄水平的調控作用[19, 20]。我們對PC12細胞p38 MAPK活化水平分析發(fā)現(xiàn)，在H2O2干預4小時后，PC12細胞phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值明顯增加，但大黃素干預組細胞p38 MAPK磷酸化水平較未干預組細胞更低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結果表明在PC12細胞中大黃素可以通過抑制H2O2誘導的p38 MAPK磷酸化減輕炎癥反應和氧化應激。

4 結論

本文研究結果提示，在PC12細胞中大黃素可能通過抑制p38 MAPK的磷酸化下調H2O2誘導的COX-2合成。該基礎研究為大黃素應用于腦卒中相關的炎癥反應和氧化應激治療以及神經元保護奠定了一定理論基礎，但仍需進一步的實驗研究證實其在臨床中的價值和意義。

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Emodin Down-regulates H2O2-induced COX-2 expression by inactivation of p38 MAPK in PC12 cells

WANG hui-juan，F(xiàn)ENG She-jun，WU yan-qiang，etal

(HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China)

Objective To explore whether emodin would inhibit H2O2-induced COX-2 expression via inactivation of p38 MAPK in neuron PC12 cells. Methods PC12 cells were divided into 3 control group, emodin+H2O2group and H2O2group. After 4 hours H2O2intervention, RT-PCR was used to measure the mRNA expression of COX-2. Meanwhile, western blot was performed to detect the protein expression of COX-2 and the ratio of phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK, which was used to analyze the activation of p38 MAPK. Results After 4 hours H2O2intervention, the mRNA and protein expression of COX-2 was noticeably up-regulated, and the phosphorylation level of p38 MAPK was sharply raised. Moreover, H2O2-induced the up-regulation of COX-2 and the raised level of phospho-p38 MAPK were both ameliorated by emodin in PC12 cells. Conclusion Emodin down-regulates the expression of COX-2 possibly via inactivation of p38 MAPK in PC12 cells.

Emodin; PC12 cells; H2O2; COX-2; p38 MAPK

河北省衛(wèi)生廳重點科技研究計劃(20130359)

李軍濤,主任醫(yī)師。E-mail：lijuntao2014@163.com

R 915

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.005

2014-07-10； 編輯： 張文秀)