陳 麗綜述，何曉英審校

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川瀘州646000）

凝血酶在腦卒中保護作用的研究進展

陳 麗綜述，何曉英審校

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川瀘州646000）

凝血酶；卒中；神經(jīng)再生；腦/血液供給；綜述

腦卒中是一組突然起病，是以局灶性神經(jīng)功能缺失為共同特征的急性腦血管疾病，包括腦出血、腦梗死及蛛網(wǎng)膜下腦出血。中國腦卒中發(fā)病率排名世界第一，比美國高1倍，腦卒中已成為中國第1位死因。腦卒中除了高致死率外，還具有高致殘率，全國存活的腦卒中患者中有3/4患有不同程度的殘疾，且呈年輕化趨勢，使正值盛年的殘疾人給家庭和社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔和社會問題。但是腦卒中病理機制復雜，治療效果仍不容樂觀，積極尋找有效措施減輕腦卒中造成的神經(jīng)功能缺失、降致殘率，是當前神經(jīng)科學研究的重要課題。

1 凝血酶結(jié)構(gòu)

人體凝血酶由輕鏈A和重鏈B構(gòu)成，其中A鏈主要作用是穩(wěn)定凝血酶的整體結(jié)構(gòu)。B鏈結(jié)構(gòu)相對復雜，主要包括以下3個位點。（1）精氨酸側(cè)鏈口袋：催化位點，主要由Asp102、His47和Set195構(gòu)成；（2）非極性結(jié)合位點：可與底物發(fā)生疏水作用；（3）陰離子結(jié)合位點：由B鏈中的6個Lys構(gòu)成，包括：LysB21、B52、B65、B106、B107、B154，可與血小板受體相互作用，另外B鏈內(nèi)有3個二硫鍵（Cys42-Cys58、Cys168-Cys182、Cys191-Cys220），具有穩(wěn)定凝血酶結(jié)構(gòu)的作用。

2 凝血酶生物特性

不管是正常生理還是在病理狀態(tài)下，凝血酶都發(fā)揮著重要的作用[1]。主要包括：（1）激活凝血因子，促進血小板聚集及加快纖維蛋白的形成；（2）趨化并促進炎性細胞到達損傷部位及分泌炎癥介質(zhì)，增強NK細胞的溶解及殺傷能力；（3）增強內(nèi)皮細胞合成能力，加快細胞因子釋放及血管的通透性；（4）促進平滑肌細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、單核細胞的增殖；（5）可調(diào)節(jié)神經(jīng)起源細胞的生長分化及死亡、血管新生、神經(jīng)保護、影響疼痛信號的傳遞、骨的形成。

3 凝血酶受體（TR）

TR經(jīng)水解后生成蛋白酶活化受體（PARs），由425個氨基酸構(gòu)成，為經(jīng)典的7次穿膜G蛋白偶聯(lián)受體，與凝血酶結(jié)合后可切斷PAR胞外N-端Arg41-Ser42間的肽鍵，激活G蛋白，從而將信號傳到細胞內(nèi)，引起細胞變化。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，凝血酶受體活化后產(chǎn)生的細胞信號更為廣泛，機制更加復雜。目前，已有4種PAR的cDNA被克隆，PAR1、PAR2、PAR3基因定位于5q13，PAR4基因定位于19p12。在神經(jīng)系統(tǒng)以PAR1介導細胞信號作用最為顯著[2]。腦卒中后TR被激活，細胞內(nèi)物質(zhì)具體包括肌醇1、三磷酸肌醇（IP3）、甘油二酯（DAG）、Ca2+、蛋白磷酸化、腺苷酸環(huán)化酶等發(fā)生改變，將細胞外信號傳入細胞內(nèi)，發(fā)揮神經(jīng)保護甚至神經(jīng)毒性作用[3]。

4 凝血酶在神經(jīng)中樞的產(chǎn)生、作用特點及清除

腦出血后凝血酶的數(shù)量明顯增加，主要由腦出血后血腫組織團塊產(chǎn)生，此外也有一部分來自血液及受損傷的腦組織本身。凝血酶在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有兩面性，既可加重腦細胞水腫，導致細胞凋亡，又可提高神經(jīng)細胞耐受能力，免受外界損傷，主要取決于受體的活化率和第二信號的清除之間的比例，低濃度（＜50 nmol/L）活化的凝血酶可不斷失活，不斷降解，使凝血酶還未發(fā)揮細胞毒性，就已經(jīng)被消除。反之，高濃度（≥50 nmol/L）時將加重腦水腫、細胞凋亡、炎性反應(yīng)及誘發(fā)癲癇等神經(jīng)毒性作用。腦卒中后，受損傷的腦組織缺血、缺氧，新陳代謝減慢，加之腦脊液循環(huán)本身就較緩慢，故凝血酶在腦組織中的清除緩慢，其作用效應(yīng)也將較其他部位延長。

5 凝血酶促進神經(jīng)突觸可塑性

神經(jīng)細胞之間信息傳遞功能的特殊接觸部位叫神經(jīng)突觸，與大腦的神經(jīng)沖動、學習、記憶有密切關(guān)系。腦卒中后神經(jīng)突觸遭到破壞，凝血酶通過直接或間接激活PAR1，參加突觸傳遞和可塑性恢復。Stein等[4]在急性腦缺血的C57BL/6小鼠中，測得細胞外LTP，指給突觸前纖維一個短暫的高頻刺激后，突觸傳遞效率和強度增加幾倍且能持續(xù)數(shù)小時至幾天保持這種增強的現(xiàn)象）明顯增強，且N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）也明顯增多，且使用凝血酶抑制劑或PAR1抑制劑可阻礙上述物質(zhì)的變化。Shimon等[5]在總結(jié)凝血酶可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性來影響神經(jīng)功能恢復中，指出凝血酶調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸是通過激活PAR1來完成的。Becker等[6]研究表明，在去神經(jīng)的小鼠齒狀顆粒細胞中，通過PAR1激活門冬氨酸受體使突觸可塑性改變。具體機制如下：腦卒中后，凝血酶活性增強，激活PAR1，NMDA通道復合體激活，LTP增強，使突觸傳遞效率增強，加快神經(jīng)突觸可塑性功能恢復，提高記憶及學習能力。

6 凝血酶促進神經(jīng)細胞再生

神經(jīng)元細胞屬于永久性細胞，無再生能力，但Yang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，存在于腦室下帶、海馬齒狀回、成年哺乳動物的皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)祖細胞存在再生的潛能，并通過實驗證實凝血酶能促進DCX（神經(jīng)元前體細胞移行過程中表達的一種微管結(jié)合蛋白），應(yīng)用水蛭素后該物質(zhì)明顯減少。d′Audigier等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在凝血酶及其受體可刺激內(nèi)皮前體細胞的分化，促進內(nèi)皮細胞增殖。Liu等[9]在脊髓損傷模型中，通過免疫印跡分析和免疫組織化學染色方法，證明Ras/Raf/ERK1/2（細胞外信號調(diào)節(jié)激酶）傳導途徑參加了神經(jīng)細胞修復。Sayyah等[10]在人類1 321 n1膠質(zhì)母細胞瘤細胞中，凝血酶可通過激活Rap1/β1整合素傳導途徑，激活下游RhoA介導和磷脂酶D，促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖。凝血酶促進神經(jīng)細胞再生可能機制：（1）凝血酶通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白使Raf活化形成Ras-GTP，與激活的PKC和Raf共同激活ERK1/2，使細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子和（或）P70核蛋白體S6激酶數(shù)量增多，促進神經(jīng)細胞再生。（2）血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）：腦神經(jīng)細胞再生與血管再生緊密聯(lián)系，VEGF為一種特異性內(nèi)皮細胞絲裂原，凝血酶通過刺激細胞分泌VEGF，為神經(jīng)細胞再生提供條件。

7 凝血酶促進腦血管再生

血管新生主要指在原有的毛細血管與微靜脈基礎(chǔ)上通過血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，從先前存在的血管處以芽生或非芽生（或稱套迭）的形式生成新的毛細血管，主要包括：血管生成因子釋放，細胞外基質(zhì)（ECM）降解，內(nèi)皮細胞增殖、遷移和浸潤；血管結(jié)構(gòu)的修整、改建。Tsopanoglou等[11]在雞尿囊絨膜（CAM）系統(tǒng)和基質(zhì)膠系統(tǒng)證實凝血酶具有促進血管新生。主要通過兩條途徑促進血管新生：（1）凝血非依賴途徑，通過調(diào)節(jié)細胞因子的表達，如缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）、VEGF、促血管生成素-1（Ang-1）、Ang-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9等，促進血管新生；（2）凝血依賴途徑，通過纖維蛋白產(chǎn)生，促進腦血管新生。

7.1 凝血非依賴途徑

7.1.1 凝血酶與HIF-1α HIF-1α在缺血缺氧條件下增多，常氧條件下幾乎不被檢測到，但凝血酶在常氧條件下就能促進血管平滑肌細胞HIF-1α的表達[12]。凝血酶促進血管新生的可能機制是凝血酶受體活化后，通過增加HIF-1α蛋白的翻譯或抑制蛋白降解，使細胞中的HIF-1α蛋白水平升高，也可調(diào)節(jié)HIF-1α的表達依賴G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）促進血管新生。

7.1.2 凝血酶與VEGF VEGF與其受體（VEGFR-1、VEGFR-2）在血管新生過程中有重要的作用。Wang等[13]將人類臍平滑肌細胞（HUASMC）暴露于凝血酶10 U/mL中，12 d后研究結(jié)果顯示，凝血酶顯著增加了HUASMC增殖（n=11，P=0.002）和 VEGF mRNA表達（n=4，P= 0.024）。凝血酶促進VEGF釋放機制：凝血酶與其受體PAR結(jié)合活化細胞內(nèi)p42/p44 MAPK，使轉(zhuǎn)錄因子SP1 Thr453和Thr739磷酸化，活化的SP1與活化蛋白-2（AP-2）形成轉(zhuǎn)錄因子復合體，結(jié)合于VEGF啟動子（-88、-66）GC富含區(qū)，促進VEGF的轉(zhuǎn)錄，加快血管內(nèi)皮細胞的形成。最近研究表明，血小板活化后，通過激活PAR1、PAR4，不僅可使VEGF增多促進血管新生，也能增加內(nèi)皮抑素的釋放抑制血管生成，但VEGF的釋放占主導地位，從而促進血管生成[14]。

7.1.3 凝血酶與Ang-1、Ang-2 Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)血管形成，主要通過激活或阻礙內(nèi)皮細胞特異性酪氨酸激酶受體（Tie2）。凝血酶活化后仍可通過激活PAR1使Ang-2基因的轉(zhuǎn)錄增多，也可促進Ang-1誘導的內(nèi)皮祖細胞遷移，促進血管生成。凝血因子Ⅹa可以通過不經(jīng)典的途徑激活PAR3受體，活化Tie2，調(diào)節(jié)血管生成及穩(wěn)定血管的完整性[15]。

7.1.4 凝血酶與整合素 整合素αVβ3表達于血管內(nèi)皮細胞，其表達被認為是內(nèi)皮細胞血管生成的標志。凝血酶通過增加整合素αVβ3 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，使整合素αVβ3明顯增多，加快內(nèi)皮細胞的黏附、遷移、存活[16]。凝血酶的RGD序列起著不可替代的作用。

7.1.5 凝血酶與MMP MMP在體內(nèi)主要作用是降解細胞外基質(zhì)（ECM）。主要通過4個方面促進血管新生：（1）降解血管基底膜及周圍的ECM，使血管新生的出芽和內(nèi)皮細胞的遷移；（2）釋放調(diào)控血管新生的細胞因子；（3）暴露ECM與integrin結(jié)合的位點；（4）分離細胞間的黏附。腦卒中后，凝血酶通過增加MMP-1、MMP-2的蛋白表達，使緊密聯(lián)系的內(nèi)皮細胞相互分離且分泌相關(guān)細胞因子，增強內(nèi)皮細胞能力遷移。Machida等[17]發(fā)現(xiàn)，腦出血后凝血酶活化后通過PAR1受體使大腦微血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和周細胞釋放MMP9，其中以周細胞釋放最多。

7.2 凝血依賴途徑 此途徑主要研究集中于腫瘤血管新生方面的研究，主要是通過凝血酶裂解纖維蛋白原進而形成纖維蛋白，也可誘導相關(guān)因子的釋放，促進血管新生。

7.3 凝血酶與Na+/Ca2+交換體（NCX） Andrikopoulos等[18]發(fā)現(xiàn)，在人血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）中，NCX參與凝血酶促進血管新生過程。具體機制：凝血酶活性增強，通過NCX使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+增多，NADPH氧化酶介導產(chǎn)生活性氧（ROS），進一步促進PAR1及ERK1/2的活化，使用抑制劑SEA0400或NCX1 siRNA均將使ERK1/2的磷酸化減弱，新生血管減少。

8 凝血酶提高神經(jīng)元耐受能力

8.1 凝血酶提高神經(jīng)元耐受能力主要表現(xiàn) 低濃度（50 pmol/L～50 nmol/L）凝血酶不僅不會損傷神經(jīng)細胞，反而可增強神經(jīng)細胞在低血糖、缺氧、缺血、外界損傷等情況下的耐受能力，使神經(jīng)細胞存活，保證其正常功能。凝血酶還可以加快神經(jīng)生長因子的合成及分泌，促進神經(jīng)細胞損傷的修復，不僅如此，小劑量凝血酶預處理腦出血大鼠后可減輕之后較大劑量凝血酶引起的腦水腫。Wang等[19]將PAR1基因敲除后可明顯加重腦水腫及神經(jīng)元的死亡及行為障礙。激活內(nèi)源性蛋白質(zhì)C使用凝血酶突變W215A/E217A治療缺血性卒中可以提高神經(jīng)元的存活和減少腦梗死灶，與組織纖溶酶原激活物治療腦梗死相比，可大大減少出血風險[20]。

8.2 凝血酶提高神經(jīng)元耐受能力可能機制 （1）與凝血酶受體PAR1活化有關(guān)，預先激活PAR1，可刺激新蛋白質(zhì)合成，并與凝血酶受體mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，從而產(chǎn)生保護作用；（2）促進熱休克蛋白（heatshock protein，HSP）激活，TPC通路信號轉(zhuǎn)導途徑，激活HSP 27，使腦細胞耐受性增加，減輕細胞腫脹及減少凋亡，從而保護神經(jīng)元；（3）PAI-1增多，PAI-1屬于體內(nèi)凝血酶抑制物，凝血酶促進PAI-1 mRNA增加，及PAI-1蛋白水平的增加，減少由于腦卒中生成大量凝血酶毒性作用，從保護神經(jīng)細胞免受損害。

近年來，凝血酶的腦保護作用已引起人們的廣泛關(guān)注，但其具體機制仍在研究中，能否在凝血酶的神經(jīng)毒性作用與神經(jīng)保護作用找到平衡，是作者奮斗的目標。合理地調(diào)節(jié)凝血酶的水平，盡可能地減少腦損傷，加快腦康復提供理論依據(jù)，為臨床治療提供新的觀念和思路。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.16.021

A

1009-5519（2015）16-2468-03

2015-05-04）

陳麗（1989-），女，重慶忠縣人，碩士研究生，主要從事腦血管方向的研究；E-mail：1156506016@qq.com。

何曉英（E-mail：102050228@qq.com）。