大建中湯對脾陽虛腹痛大鼠CaMKⅡmRNA的影響*

★武靜*黃順

(貴陽中醫(yī)學院貴陽 550001)

摘要：目的：觀察大建中湯對脾陽虛疼痛大鼠大腦中環(huán)氧合酶-2(COX-2)mRNA的影響，探討大建中湯對脾陽虛疼痛的作用機理。方法：將SD大鼠40只隨機分為正常組、模型組、大建中湯大、小劑量組各10只，采用綜合造模法制備脾虛動物模型，根據(jù)實驗分組以灌胃形式進行給藥，各組大鼠連續(xù)給藥15天后，斷頸處死大鼠并立即取腦組織。用RT-PCR法分析檢測腦組織CaMKⅡmRNA表達的變化。結果：與正常對照組相比，脾陽虛模型組大鼠大腦CaMKⅡmRNA表達明顯增加，具有顯著統(tǒng)計學意義(P﹤0.01)；大建中湯高劑量組CaMKⅡ表達與模型組相比明顯下降，具有顯著性差異(P﹤0.01)。結論：CaMKⅡmRNA在脾陽虛疼痛中高表達，大建中湯可抑制脾陽虛疼痛大鼠大腦中CaMKⅡ的表達，并可能通過此抑制作用來達到治療疼痛的目的。

關鍵詞：大建中湯；脾陽虛；大鼠；環(huán)氧合酶-2；RT-PCR

躲避疼痛是機體對有害刺激的一種生理現(xiàn)象，然而對于長期性的慢性疼痛以及嚴重的病理性疼痛會明顯降低患者的生活質(zhì)量。Ca2+/ 鈣調(diào)蛋白(CaM)依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ) 是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，現(xiàn)已被證實其是神經(jīng)元突觸后致密物(SD)的主要成分，參與痛覺過敏的形成。而大建中湯是臨床治療脾陽虛疼痛的經(jīng)典方劑，對陽虛引起的疼痛療效確切，本實驗通過大建中湯治療脾陽虛動物模型，了解大建中湯治療后CaMKⅡ的變化，明確該傳統(tǒng)方劑對疼痛治療發(fā)揮作用的機理。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 40只清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重200±20g(由重慶騰鑫生物技術有限公司提供。置于安靜，溫度恒定(22±2)oC環(huán)境中飼養(yǎng)3d。隨機分為正常組、模型組、大建中湯大、小劑量組，每組10只。

1.2 主要儀器、試劑及藥物 渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、分光光度計(Therno scientific)、熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)；TRNzol總RNA提取試劑(天根生化科技(北京)有限公司)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa(寶生物))、SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus), ROX plus(TaKaRa(寶生物))、引物合成(Invitrogen)；中藥材均購自貴陽同濟堂大藥店，經(jīng)貴陽中醫(yī)學院方藥教研室汪毅教授鑒定為正品。造模用番瀉葉水浸液制備: 將番瀉葉按1∶1比例與水混合，于恒溫水浴箱中 (70oC浸泡24h將浸得液用3層紗布過濾后在4oC冰箱中保存?zhèn)溆?。治療用藥大建中湯的制? 蜀椒( 炒去汗) ∶ 干姜∶人參∶飴糖( 烊化)=1∶2 ∶1 ∶5，分別制成a高劑量( 含生藥1.5g/mL)、b低劑量( 含生藥0.375g/mL) 兩種濃度水煎液。

1.3 模型制備及給藥 參照陳氏[1]文獻報道的綜合造模法改進：將大鼠正常飼養(yǎng)3d，使之適應環(huán)境后開始造模。前5天，單日喂飼甘藍10g/200g，雙日喂飼精煉豬油2mL/200g，每日38oC溫水中游泳至疲勞。后6~21d，除以上因素外，加上每日灌番瀉葉水浸液2mL/200g。成功復制脾陽虛模型。給藥方法：從第實驗22d開始給藥，正常組正常飼養(yǎng)；模型組灌服2mL/kg/d生理鹽水；大建中湯治療組：分大、小劑量組，分別灌服a、b水煎劑2mL/kg·d，以上各組灌胃均為15d。

1.4 標本采集 各組實驗結束后，次日將大鼠處死并立即取腦組織，置于-80e冰箱保存待用。

1.5 CaMKⅡmRNA檢測 采用RT-PCR法，CaMKⅡ上游引物：5’-GAAGACCAAGTGGAGCCTGAC-3’，下游引物：5’-GGACCGAATCGACAAAGAAG-3’，產(chǎn)物大?。?91 bp 。GAPDH 上游引物：5’-GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3’，下游引物：5’-AAGGTGGAAGAATGGGAGTT-3’，產(chǎn)物大?。?08 bp。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS統(tǒng)計軟件20.0單因素方差分析實驗數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1大鼠處于脾陽虛疼痛后一般狀態(tài)觀察 實驗組大鼠出現(xiàn)倦怠、喜聚堆、腹瀉、皮毛枯槁易落、不能堅持游泳、肛周污濁、抽搐等現(xiàn)象，表明造模成功。

2.2大建中湯對各組大鼠腦組織CaMKⅡmRNA含量的影響 與正常對照組比較，模型組中CaMKⅡmRNA表達明顯升高，大建中湯高劑量組和低劑量組CaMKⅡmRNA表達與模型組相比明顯降低(P﹤0.01) ，提示大建中湯能降低脾陽虛大鼠腦組織中CaMKⅡmRNA的表達。，見圖1、表1。

圖1　各組大鼠腦組織中CaMKⅡmRNA RT-PCR電泳圖

3討論

本實驗通過飲食失調(diào)傷脾胃、疲勞過度傷脾氣、苦寒瀉下傷脾陽等綜合措施成功復制了脾陽虛腹痛證模型。近年來，學者們發(fā)現(xiàn)在反應及傳導傷害性刺激過程中，神經(jīng)系統(tǒng)的中樞敏化機制起到了非常重要的作用，推測細胞內(nèi)Ca2+相關級聯(lián)反應所引起的傷害感受性受體敏化可能是慢性痛神經(jīng)生理學機制之一，這越來越多的研究人員都已經(jīng)證實了這一結論并已形成了的共識[2-3]。而大建中湯作為治療脾陽虛所致慢性腹痛的經(jīng)典方劑，我們推測大建中湯對這一過程亦有影響，為進一步明確其鎮(zhèn)痛的分子機制，筆者將從細胞信號傳導信使CaMKⅡ進行深入研究。大量報道證實，各種鈣調(diào)節(jié)傳導不同的信號過程是通過Ca2+濃度的改變完成的，其中鈣調(diào)素依賴蛋白激酶發(fā)揮的作用尤為重要[4]，它屬于Ca2+鈣調(diào)節(jié)素依賴蛋白激酶家族(Ca2+CaMK)中的一員。

表1　大建中湯對各組大鼠腦組織CaMKⅡmRNA含量的影響

注：與正常對照組比較，*P﹤0.01; 與模型組比較，﹟P﹤0.01;·P﹤0.01。

Ca2+鈣調(diào)蛋白(CaM)依賴的蛋白激酶2(calmodulin dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)是一種多功能絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，它大量分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中[5]，在腦中CaMKⅡ的含量也相對較高，約占全腦總蛋白的2%左右[6]。有研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ作為大腦中含量最高的蛋白激酶，在記憶和學習中，CaMKⅡ的自身磷酸化是記憶的一種分子機制，CaMKⅡ是其過程的分子基礎[7-8]。田徐露等[9]報道稱，具有特殊結構和機制的CaMKⅡ，在急性、慢性疼痛所致的外周及中樞敏化過程中起著十分重要作用。張楠等[10]研究發(fā)現(xiàn)CaMKII在Ca2+敏感的急慢性疼痛信號通路中起到核心作用，它神經(jīng)可塑性改變基礎是不同外界刺激引起的。另有學者發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白復合體的形成是由細胞內(nèi)Ca2+促進而成的，從而激活CaMKⅡ并對AMPA(α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸)受體的磷酸化。Ca2+/鈣調(diào)蛋白-鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ-谷氨酸受體(Ca2+/CaM-CaMKⅡ-GluR)信號傳到通路是慢性疼痛的基礎條件。王慧等[11]的實驗表明大建中湯對脾陽虛大鼠腹痛治療作用療效可靠，本研究進一步表明脾陽虛癥能導致腦組織中CaMKⅡ的基因表達異常，大建中湯能顯著改善這種表達異常，下調(diào)CaMKⅡmRNA的表達，說明大建中湯能作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CaMKⅡ的作用。大建中湯具有散寒止痛、補虛緩急之功效，是治療虛寒引起腹痛的經(jīng)典方劑，治療脾陽虛癥療效確切，通過本研究證實，在脾陽虛癥腹痛時，腦組織中的CaMKⅡmRNA的表達異常，大建中湯能顯著對抗這種表達異常，這可能是其治療脾陽虛癥作用環(huán)節(jié)之一。

參考文獻

[1]大建中湯對脾陽虛大鼠TXB2及6-Keto-PGFa的影響[J].江蘇中醫(yī)藥，2003,24(2)：49.

[2]Fang L, Wu J, Lin Q, et al. Calcium-calmodulin-dependent protein kinase II contributes to spinal cord central sensitization [J]. J Neurosci 2002,22 (10): 4 196-4 204.

[3]Kawasaki Y, Kohno T, Zhuang ZY, et al. Ionotropic and metabotropic receptors, protein kinase A, protein kinase C, and Src contribute to C-fiber-induced ERK activation and cAMP response element-binding protein phosphorylation in dorsal horn neurons, leading to central sensitization[J]. J Neurosci 2004，24 (38): 8 310-8 321.

[4]PassierR,ZengH,FreyN,e tal.CaMkinasesignalinginducescar-diachpertrophyandactivatestheMEF2transcriptionfactorinvi-vo[J].J ClinInvest,2000,105(10):1395-1406.

[5]Soderling TR. CaM-kinases: modulators of synaptic plasticity[J].Curr Opin Neurobiol,2000,10(3):375-380.

[6]Lisman J,Schulman H,Cine H.The molecular basis of CaMKⅡ function in synaptic and behavioural memory[J].Nat Rev Neurosci,2002,3(3):175-190.

[7]孫臣友，胡偉。莪術油改善慢性低氧大鼠學習與記憶能力[J]. 生理學報，2008，60(2)：228.

[8]Kelly MT,Crary JF,Sacktor TC.Regulation of protein kinase Mzatasythesis by multiple kinases in long-term potentiation[J].J Neurosci,2007,(27):34,39.

[9]田徐露，陳勝良，曹芝軍.CaMKⅡ參與內(nèi)臟痛覺調(diào)節(jié)的機制.胃腸病學，2011，16(4)：235-237.

[10]張楠，卜祥寧，方力，等. CaMKⅡ信號轉(zhuǎn)導通路在慢性痛外周和中樞感受器中的作用[J].Chinese Journal of Clinical Anatomy，2008，26(3):344-346.

[11]王慧,武靜,陳繼婷，等. 脾陽虛大鼠下丘腦星形膠質(zhì)細胞GFAP和小膠質(zhì)細胞OX42的表達及大建中湯的干預作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24(2): 304-305.

收稿日期：(2015-02-10)編輯：王河寶

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：B

通信作者：武靜(1981—)，男，碩士，講師。研究方向：中西醫(yī)結合基礎。Tel：18286037064。

基金項目：貴州省中醫(yī)藥管理局項目( QZYY2013-109)；貴陽中醫(yī)學院科研項目(貴中醫(yī)科院內(nèi)【2014】29號)；貴陽中醫(yī)學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(貴中醫(yī)大創(chuàng)合字【2014】45號)。