基于電化學(xué)基因傳感器的冬蟲夏草及其偽品北蟲草的鑒別*

★丁妍華*謝一輝張秀秀王瓊樊浩*

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院南昌 330004)

摘要：目的：構(gòu)建一種能夠靈敏鑒別中藥冬蟲夏草及其偽品北蟲草的電化學(xué)基因傳感器。方法：β-環(huán)糊精修飾的具有特異性分子識(shí)別特性的金納米顆粒(Au-CDS)被用作電化學(xué)信號(hào)提供者和主體分子。用3’端標(biāo)有dabcyl，5’端標(biāo)有氨基的發(fā)卡探針DNA進(jìn)行電極修飾，冬蟲夏草的DNA片段可以和該探針DNA形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而將目標(biāo)雜交事件轉(zhuǎn)換為Au-CDS提供的電流信號(hào)，該信號(hào)變化可通過(guò)循環(huán)伏安法靈敏檢測(cè)，目標(biāo)DNA特異性基因位點(diǎn)的微小差異可產(chǎn)生顯著的電流響應(yīng)差異。結(jié)果：可靈敏檢測(cè)2.6×10-12M的目標(biāo)DNA。結(jié)論：該傳感器為冬蟲夏草的快速鑒別提供了一種新方法和工具。

關(guān)鍵詞：冬蟲夏草基因鑒別；電化學(xué)傳感器；雙標(biāo)記DNA探針；主客體識(shí)別

為了控制中藥質(zhì)量、保證臨床用藥的安全有效，中藥鑒定成為中醫(yī)藥研究的重要工作。傳統(tǒng)的中藥材鑒別主要依據(jù)形態(tài)學(xué)特征和理化性質(zhì)，但物種的差異歸根結(jié)底是由于它們的DNA序列不同，所以最具有決定意義的是分子生物學(xué)層次的鑒定。目前應(yīng)用于藥用植物鑒別的分子生物學(xué)方法主要有：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP) 、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、隨機(jī)引物PCR(AP-PCR)、DNA指紋技術(shù)(DAF)和生物芯片等技術(shù)[1]，也取得了一定成果：對(duì)雷公藤的ITS and 5S rDNA 序列進(jìn)行分析，為雷公藤的分子鑒定提供了依據(jù)[2]。采用PCR直接測(cè)序技術(shù)測(cè)定五鶴續(xù)斷的18S rRNA基因核苷酸序列及大青葉核基因ITS2區(qū),為這兩種中藥材的分子鑒定提供了依據(jù)[3-4]。通過(guò)對(duì)當(dāng)歸及其混偽品中藥材rDNA ITS序列的分析，發(fā)現(xiàn)rDNA ITS序列特征可作為當(dāng)歸及其混偽品藥材鑒別的有效分子標(biāo)記[5]。電化學(xué)DNA傳感器因其具有不破壞測(cè)試樣品、不受溶液顏色影響、靈敏、快速、簡(jiǎn)便、便于微型化等優(yōu)點(diǎn),已逐漸成為分子生物學(xué)研究中對(duì)DNA 序列進(jìn)行直接檢測(cè)的方法之一[6]。但是目前來(lái)說(shuō)，電化學(xué)DNA傳感技術(shù)應(yīng)用于中藥材基因鑒定的研究是非常少的[7]。針對(duì)當(dāng)今中藥市場(chǎng)假冒偽劣的冬蟲夏草混淆品的情況，構(gòu)建一種操作簡(jiǎn)單，靈敏，快速，便攜的基因鑒別電化學(xué)傳感器是一項(xiàng)很有意義的研究。

該課題組研究了一種基于4-4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸(dabcyl)與環(huán)糊精主客體分子識(shí)別作用電化學(xué)檢測(cè)均相溶液發(fā)生的DNA雜交的新方法[8-9]。環(huán)糊精(CDs)是一種內(nèi)部有疏水性空腔而外部是親水的環(huán)形結(jié)構(gòu)的低聚糖。這種特殊結(jié)構(gòu)賦予環(huán)糊精及其衍生物特異的識(shí)別和包裹客體分子的能力。作者合成了一種表面固定了β-環(huán)糊精金納米顆粒(Au-CDS)，用作電化學(xué)信號(hào)提供者和具有特異性分子識(shí)別特性的主客體識(shí)別者。3’端標(biāo)有dabcyl，5’端標(biāo)有巰基的發(fā)卡DNA被用作探針DNA，并預(yù)先通過(guò)金硫鍵自組裝在金電極表面，如圖1所示，在傳感器的初始狀態(tài)，由于探針DNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的空間位阻效應(yīng)，dabcyl難以被溶液中Au-CDS。在目標(biāo)DNA檢測(cè)時(shí)，探針DNA發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變，迫使dabcyl遠(yuǎn)離電極表面，從而可被Au-CDS通過(guò)主客體識(shí)別捕獲，即可實(shí)現(xiàn)將目標(biāo)雜交事件轉(zhuǎn)換為Au-CDS提供的電流信號(hào)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 β-CDs購(gòu)自Sigma Aldrich化學(xué)集團(tuán)；dabcyl標(biāo)記的發(fā)卡DNA探針、三堿基錯(cuò)配DNA以及完全不互補(bǔ)DNA均購(gòu)自上海Sangon生物技術(shù)公司，并通過(guò)HPLC純化。冬蟲夏草以及北蟲草DNA是從中藥材中提取并鑒定。具體基因序列如下：dabcyl標(biāo)記的冬蟲夏草基因發(fā)卡探針DNA(Probe DNA)：5’-SH- CCACGCATTTCGGGGCGTGG-DABCYL-3’；三堿基錯(cuò)配序列(購(gòu)買)：5’- GCCCCGTTTTG -3’；完全不互補(bǔ)序列(購(gòu)買)：5’ -GCATTTCGGGG-3’；目標(biāo)DNA(冬蟲夏草基因片段)： 5’-GCCCCGAAATG-3’；單堿基錯(cuò)配DNA(北蟲草同等位置的基因片段)： 5’- CCCCCGAAATG -3’；其余化學(xué)試劑均購(gòu)自中國(guó)上海鼎國(guó)生物科技公司；所有溶液均是由Millipore Milli-Q system超純水配制；所用試劑若無(wú)特殊說(shuō)明，均為分析純。

1.2 儀器 原子力顯微鏡(SEM)(瑞士 Nanosurf EasyScan)；電化學(xué)分析儀(美國(guó)CHI 660)；電化學(xué)反應(yīng)池(5mL)；電化學(xué)系統(tǒng)(鉑絲作對(duì)電極；Ag/AgCl(飽和KCl溶液)電極作參比電極；探針DNA修飾的玻碳電極(直徑3 mm)作為工作電極)。

參考文獻(xiàn)1.3 巰基環(huán)糊精(SH-β-CD)的制備 SH-β-CD合成并原有基礎(chǔ)上有所改進(jìn)[10]。首先，取5.20g(20 mmol)三苯基膦 和5.05g(20 mmol)碘液加入20mL DMF溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，邊攪拌邊加入1.10 g(1.0 mmol)β-CD，混合后的溶液在80℃條件下攪拌15h，然后濃縮到一半的體積，加入甲醇鈉的甲醇溶液(3 M, 8.0 mL)調(diào)pH9-10，并冷卻。將上述溶液置于室溫下30min以破壞反應(yīng)過(guò)程中生成的酯，然后倒入100mL的冰甲醇溶液中，隨后再倒入500mL的冰水，生成沉淀。過(guò)濾出沉淀，并用水和甲醇洗滌，干燥，得到白色粉末狀SH-β-CD(1.56g, 0.82mmol)。將上述實(shí)驗(yàn)得到的SH-β-CD(1.56g, 0.82mmol)溶于16mL DMF中，再加入0.48g(6.4mmol)硫脲，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱到70℃。反應(yīng)19h之后，減壓使DMF下變成黃色油狀物并溶于90mL水中，剩余的反應(yīng)物中加入0.42g(1.05mmol)氫氧化鈉,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下低溫回流1小時(shí)，得到的懸浮物用KHSO4酸化，濾出沉淀物，用蒸餾水洗凈，烘干。為了除去殘留的DMF，將得到的產(chǎn)品溶于水形成懸濁液，再加入極少量的KOH形成一個(gè)澄清的溶液，加入KHSO4的水溶液再沉淀。沉濾出沉淀物，真空干燥，得到黃白色粉末狀的SH-β-CD(0.85g，0.83mmol)，熔點(diǎn)134-136℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ5.92 (d, J = 6.0 Hz, 7 H), 5.82 (s, 7 H), 4.93 (s, 7 H), 3.68 (t, J = 6 Hz, 7 H), 3.61 (t, J = 7.5 Hz, 7 H), 3.19 (br d, J = 15 Hz, 7 H), 2.77-2.74 (m, 7 H), 2.13(t, J = 6.0 Hz, 7 H). MS (ESI) m/z [M + Na]+: 1269.1920。 圖7目標(biāo)DNA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍

1.4 巰基環(huán)糊精功能化的金納顆粒(Au-CDs)的制備 巰基環(huán)糊精功能化的金納米參照文獻(xiàn)合成[11]。取0.6mM的 HAuCl4的(H2O:DMSO=1∶4)溶液20mL，加入16mL含有8.0mg SH-β-CD 和 60.4mg NaBH4的DMSO溶液，混合均勻，在室溫下持續(xù)攪拌24h，之后加入32mL CH3CN，離心，棄去上清液，得到的沉淀分別用50mL CH3CN:DMSO (1∶1, v/v)和50mL無(wú)水乙醇洗滌，離心，棄去上清液。得到的樣品真空干燥后置于60℃環(huán)境下過(guò)夜，之后室溫保存。

1.5 羧基功能化的碳納米管改性玻碳電極的制備 將玻碳電極(直徑3mm)在砂紙和涂有Al2O3(粒徑在0.05 m 和 0.3 m之間)白漿的麂皮上仔細(xì)打磨干凈，隨后置于蒸餾水中超聲清洗。在超聲攪拌情況下，將1 mg羧基功能化的碳納米管溶解到1mL的蒸餾水中，溶液呈黑色。取5μL上述溶液，滴加到玻碳電極表面，置于紅外燈下干燥并形成黑色均勻的薄膜，即得到MCNTs/GCE。

1.6 Probe DNA修飾電極的制備 取5 μL 100 mg /mL EDC溶液滴加到 MCNTs/GCE電極表面，隨后立即再取5 μL 100 mg /mL NHS溶液滴加到電極表面。在濕度為100%環(huán)境下，將電極浸入到probe DNA溶液中反應(yīng)2h。反應(yīng)完全后，用去離子水沖洗電極表面，得到Probe DNA/MCNTs/GCE待用。

1.7 DNA電化學(xué)檢測(cè) DNA檢測(cè)過(guò)程：首先將制備好的Probe DNA/MCNTs/GCE電極浸入含有target DNA和Au-CDs的溶液中，37℃反應(yīng)1h，目標(biāo)DNA與探針DNA形成雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)，迫使dabcyl遠(yuǎn)離電極表面，如圖1所示，從而可以被Au-CDS通過(guò)主客體識(shí)別捕獲進(jìn)入到納米顆粒表面的β-CD空腔中，這樣，Au-CDs即被帶到電極表面，將反應(yīng)后的電極取出，去離子水充分洗滌后，再在1mL0.1M HCl溶液中在+1.25V(vs. Ag/AgCl)預(yù)處理120s使金納米顆粒氧化成AuCl4-,隨后在50mV脈沖幅度和50ms脈沖寬度下從+0.7V到0.0V掃DPV。在此電位掃描過(guò)程中，約在0.4V得到還原AuCl4-的良好電化學(xué)信號(hào)，可用于目標(biāo)DNA的特異性識(shí)別和定量分析。

圖1　基于主客體識(shí)別技術(shù)構(gòu)建的DNA電化學(xué)傳感器

2 結(jié)果和討論

2.1 雜交條件優(yōu)化 雜交體系的pH及雜交溫度對(duì)Probe DNA與目標(biāo)DNA交形成雙螺旋DNA結(jié)構(gòu)有一定影響。因此，我們做了一系列的實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化雜交體系。我們研究了pH6.5到pH8.0間雜交體系的酸度對(duì)雜交反應(yīng)的影響，不同pH值環(huán)境下的DPV信號(hào)有著較為顯著的差異，如圖2所示， pH在7.2附近，得到最大的DPV信號(hào)，故選pH7.2為最適pH。如圖3所示。雜交溫度對(duì)雙螺旋DNA的形成同樣有影響，故而我們探索了25到40℃間不同溫度下0.1 M磷酸緩沖液中發(fā)生的雜交反應(yīng)。DPV信號(hào)在35℃到40℃間出現(xiàn)平臺(tái)(圖3)，因此選擇37℃作為實(shí)驗(yàn)雜交溫度。

2.2 基于主客體識(shí)別的冬蟲夏草基因電化學(xué)DNA傳感研究 為了研究基于主客體識(shí)別的電化學(xué)DNA傳感器的構(gòu)建技術(shù)，我們進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。首先，將Probe/MCNTs/GCE浸入含有只含有Au-CDs的溶液空白中，在37℃條件下孵育1h,如圖4所示，只得到一個(gè)相對(duì)小的電流信號(hào)(a)。相反地，當(dāng)Probe/MCNTs/GCE浸泡到包含target DNA 和Au-CDS的溶液中1h，我們能得到一個(gè)顯著的電化學(xué)信號(hào)(圖4)。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，當(dāng)Probe DNA 和 Target DNA雜交之后，Probe DNA末端的dabcyl被Au-CDS上的環(huán)糊精捕獲，進(jìn)而產(chǎn)生一個(gè)顯著的電化學(xué)信號(hào)。

圖2　不同pH下目標(biāo)DNA的DPV信號(hào)

圖3　在不同的雜交溫度下，檢測(cè)8.4×10-7

圖4　空白PBS溶液與含2.8×10-10

2.3 基于主客體識(shí)別的電化學(xué)DNA傳感對(duì)冬蟲夏草及其偽品北蟲草的鑒別研究 該研究對(duì)電化學(xué)DNA傳感器的特異性進(jìn)行了一系列試驗(yàn)。使用傳感器對(duì)一系列不同的DNA進(jìn)行了檢測(cè)，所得到的電流信號(hào)如圖所示，傳感器與完全非互補(bǔ)的DNA作用得到的電化學(xué)信號(hào)(圖5,a)與非特異性吸附所產(chǎn)生的信號(hào)(圖5,b)相近，同樣三堿基錯(cuò)配的DNA也不能產(chǎn)生明顯的電信號(hào)(圖5,c)變化。這說(shuō)明Probe DNA在未雜交時(shí)，保持莖環(huán)結(jié)構(gòu)，有效阻礙了dabcyl被Au-CDs上的環(huán)糊精捕獲，在電極表面只有很小的非特異性吸附同時(shí)僅僅產(chǎn)生很小的DPV信號(hào)。當(dāng)北蟲草基因序列雜交，得到較小的電化學(xué)信號(hào)(圖5,d)僅為冬蟲夏草基因(圖5,e)的三分之一左右,冬蟲夏草和北蟲草同等位置的DNA片段只有一個(gè)堿基不同，而得到的電化學(xué)信卻相差很大。顯著的信號(hào)差異表明探針 DNA能很好特異性識(shí)別目冬蟲夏草與北蟲草基因的SNP，該研究構(gòu)造的電化學(xué)DNA傳感器能夠有效的區(qū)分冬蟲夏草與北蟲草基因的SNP，從而快速鑒別冬蟲夏草和北蟲草。

圖5　傳感器檢測(cè)不同目標(biāo)DNA得到的DPV信號(hào)：(a)完全

該研究表明，不同濃度目標(biāo)DNA，得到的作為雜交信號(hào)的AuCl4-的還原峰電流不同。如圖6所示，隨互補(bǔ)序列DNA濃度的連續(xù)增大，得到的DPV信號(hào)也相應(yīng)增強(qiáng)。如圖7所示，DPV信號(hào)與目標(biāo)DNA濃度在3.4×10-12到3.4×10-9M濃度范圍內(nèi)呈對(duì)數(shù)關(guān)系，得到相關(guān)系數(shù)為0.9876的校準(zhǔn)方程式y(tǒng)=1.109logx+1.3(x是DNA的濃度,單位：pM, y是峰電流)，檢測(cè)限為2.6×10-12M。

3 結(jié)論

該研究構(gòu)建的電化學(xué)基因傳感器，能夠?qū)?.6×10-12M的冬蟲夏草DNA片段具有較靈敏的電信號(hào)響應(yīng)，解決了微量藥材的鑒定難題，為今后中藥材鑒定提供了新思路?；诜肿幼R(shí)別技術(shù)的電化學(xué)DNA傳感器能夠特異性的識(shí)別基因片段差異極小的冬蟲夏草和北蟲草，保證了對(duì)冬蟲夏草高效精準(zhǔn)的鑒定。電化學(xué)基因傳感器本身具有的不破壞測(cè)試樣品、不受溶液顏色影響、靈敏、快速、便于微型化等優(yōu)點(diǎn)都預(yù)示著它在中藥鑒定中的廣闊前景。

圖6　Probe DNA/MCNTs/GCE分別不同濃度

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收稿日期：(2015-04-08)編輯：曾文雪

中圖分類號(hào)：R282.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

通信作者：樊浩 (1980一),男，副教授。研究方向：中藥鑒定和生物傳感器。E-mail:fanhao11@yahoo.com.cn。

基金項(xiàng)目：第一作者：丁妍華(1990—)，女，在讀碩士研究生。E-mail: dyh1107@126.com。