炎癥性腸病患者外周血白細(xì)胞介素-22、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、巨噬細(xì)胞移動抑制因子表達(dá)及其臨床意義

張陳霏1趙光耀1虞竹雯1戴娟2朱蘭香1陳衛(wèi)昌1*

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科1(215006)常州市第一人民醫(yī)院消化科2

背景：近年來炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病率呈上升趨勢，其發(fā)病機制尚未完全闡明。目的：探討IBD患者外周血白細(xì)胞介素-22(IL-22)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)表達(dá)及其臨床意義。方法：納入2011年5月-2014年11月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的IBD患者80例，其中克羅恩病(CD)43例，潰瘍性結(jié)腸炎(UC)37例；健康體檢者40名作為正常對照組。采用ELISA法檢測外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平，對CD和UC活動期IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平行多因素Logistic回歸分析，并以ROC曲線評價IL-22、MMP-9、MIF篩查CD和UC活動期的診斷性能。結(jié)果：CD組和UC組外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)，CD組與UC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CD和UC活動期外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平較緩解期顯著升高(P<0.05)；IL-22、MMP-9聯(lián)合檢測篩查IBD活動期的ROC曲線下面積(AUC)(CD：0.853，UC： 0.867)優(yōu)于IL-22、MMP-9、MIF三項指標(biāo)單獨檢測(CD：0.747、0.770和0.699，UC： 0.774、0.815和0.761)。結(jié)論：IBD患者外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平顯著升高，且與疾病活動性密切相關(guān)。IL-22、MMP-9聯(lián)合檢測有利于提高IBD活動期篩查的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞Crohn??；結(jié)腸炎, 潰瘍性；白細(xì)胞介素22；基質(zhì)金屬蛋白酶9；巨噬細(xì)胞移動抑制因子

Macrophage Migration Inhibitory Factor

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組病因未明的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)。近年來IBD的發(fā)病率呈上升趨勢，其發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認(rèn)為可能與遺傳、環(huán)境、腸道微生物以及機體免疫機制異常有關(guān)，其中免疫機制異常已成為IBD發(fā)病機制的研究重點[1]。白細(xì)胞介素-22(interleukin-22, IL-22)是IL-10細(xì)胞因子家族成員，參與抗微生物防御、組織損傷修復(fù)以及急性期反應(yīng)?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是一類蛋白水解酶，主要功能是分解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，參與人體多種生理以及病理過程。巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)是一種促炎細(xì)胞因子，在多種自身免疫性疾病以及炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。近年研究[2-5]發(fā)現(xiàn)，IBD患者外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平顯著升高。本文通過檢測IBD患者的外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平，并分析其與疾病活動性的關(guān)系，旨在探討這三項指標(biāo)在IBD發(fā)病過程中的作用及其臨床意義。

對象與方法

一、研究對象

納入2011年5月-2014年11月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的IBD患者。IBD診斷標(biāo)準(zhǔn)參考“炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)”[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他胃腸道疾病(如缺血性腸病、腸道血管畸形、嗜酸細(xì)胞性胃腸炎等)、感染性疾病、腫瘤性疾病、結(jié)締組織??；肝腎功能障礙；近一個月有外傷或手術(shù)史；妊娠或哺乳期婦女；無法提供可靠病史。根據(jù)CD活動指數(shù)(CDAI)和Mayo評分系統(tǒng)評估CD和UC疾病活動性。選取同期蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院的健康體檢者作為正常對照組。本研究方案經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選者均簽署知情同意書。

二、方法

采集入選者清晨空腹外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝，室溫靜置1 h，3 500 r/min離心5 min，吸取上層血清，置于干燥潔凈凍存管中，-80 ℃保存待測。采用ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)檢測IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平，實驗步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度(A)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

一、一般情況

共80例IBD患者納入研究，CD組43例，其中男30例，女13例，年齡16~68歲，平均(31.77±11.24)歲，CD緩解期17例，活動期26例；UC組37例，其中男16例，女21例，年齡19~72歲，平均(45.22±14.74)歲，UC緩解期10例，活動期27例。正 常對照組40名，其中男22名，女18名，年齡25~52歲，平均(36.65±6.82)歲。三組間性別構(gòu)成、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

二、外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)情況

ELISA法檢測結(jié)果顯示，CD組、UC組IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平均較正常對照組顯著升高(P<0.001)，CD組與UC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1CD組、UC組以及正常對照組外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平(±s)

組 別例數(shù)IL-22(ng/L) MMP-9(μg/L)MIF(μg/L)正常對照組4023.39±3.97 484.62±60.24 43.26±8.97CD組4331.25±5.07*617.97±109.66*60.71±13.60*UC組3732.53±4.99*637.50±101.72*57.13±12.12*

*與正常對照組比較，P<0.001

三、IBD活動期和緩解期外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)情況

ELISA法檢測結(jié)果顯示，CD活動期和UC活動期IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平分別較CD緩解期和UC緩解期顯著升高(P<0.05)(表2)。

表2IBD活動期和緩解期外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平(±s)

組 別例數(shù)IL-22(ng/L) MMP-9(μg/L)MIF(μg/L)CD組 緩解期1728.82±4.80 555.87±84.53 54.88±12.63 活動期2632.84±4.67*658.58±106.27*64.51±13.05*UC組 緩解期1029.08±3.78552.64±105.8249.42±10.20 活動期2733.83±4.84*668.93±81.58*59.98±11.67*

*與同組緩解期比較，P<0.05

四、外周血IL-22、MMP-9、MIF篩查IBD活動期的診斷性能

A: CD活動期；B: UC活動期
圖1外周血IL-22、MMP-9、MIF單項檢測和IL-22、MMP-9聯(lián)合檢測Logistic回歸預(yù)測變量PRE的ROC曲線

首先對CD活動期和UC活動期外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平行多因素逐步Logistic回歸分析，兩組均為IL-22、MMP-9進(jìn)入概率預(yù)測模型(P<0.05)。兩組 IL-22與MMP-9間均無相關(guān)性(CD組：rs=0.030，P=0.848；UC組：rs=0.287，P=0.085)。CD活動期概率預(yù)測模型：概率值(PRE)=1/[1+e-(-12.638+0.197×IL-22+0.012×MMP-9)]；UC活動期概率預(yù)測模型：PRE=1/[1+e-(-14.006+0.216×IL-22+0.013×MMP-9)]。然后分別以兩組模型的PRE擬合ROC曲線，外周血IL-22、MMP-9、MIF單項檢測以及IL-22、MMP-9聯(lián)合檢測篩查IBD活動期的ROC曲線見圖1，ROC曲線下面積(AUC)等診斷性能參數(shù)見表3。單項檢測時，

表3　外周血IL-22、MMP-9、MIF篩查IBD活動期的診斷性能參數(shù)

MMP-9 AUC最大(CD： 0.770，UC： 0.815)，表明三項指標(biāo)中MMP-9是篩查IBD活動期的最佳單項檢測指標(biāo)。IL-22、MMP-9聯(lián)合檢測時，篩查CD和UC活動期的AUC分別為0.853和0.867，大于各指標(biāo)單項檢測，表明聯(lián)合檢測的診斷性能優(yōu)于單項檢測。

討論

IBD免疫反應(yīng)異常包括固有免疫反應(yīng)異常和適應(yīng)性免疫反應(yīng)異常，前者主要由細(xì)胞膜表面的Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)和細(xì)胞質(zhì)中的NOD樣受體(NOD-like receptors, NLRs)介導(dǎo)，后者的產(chǎn)生主要源自T細(xì)胞，Th1/Th2細(xì)胞調(diào)節(jié)失衡在其中起重要作用[7-8]。Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可由IL-22誘發(fā)，引起干擾素-γ(IFN-γ)、IL-2等炎性細(xì)胞因子釋放。Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可釋放IL-4、IL-5、IL-13等炎性細(xì)胞因子[1]。此外，近年研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞亦參與了異常的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，其可在IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、IL-23等的刺激下產(chǎn)生IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等[9-10]。上述因素共同作用，最終導(dǎo)致IBD發(fā)生、發(fā)展。

IL-22來源于固有免疫反應(yīng)或適應(yīng)性免疫反應(yīng)，由活化的T細(xì)胞(主要為Th17細(xì)胞和Th22細(xì)胞)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、γδT細(xì)胞、淋巴組織誘導(dǎo)(LTi)細(xì)胞、LTi樣細(xì)胞等產(chǎn)生，借助皮膚、消化道黏膜、呼吸道黏膜、胰、腎、肝等組織中的IL-22-IL-22受體(IL-22R)復(fù)合物，經(jīng)由JAK-STAT信號通路發(fā)揮作用[11]。研究[2-3,12-13]發(fā)現(xiàn)，IBD患者外周血和腸道黏膜組織中IL-22表達(dá)增加，且與疾病活動性相關(guān)，可能與腸道損傷后引起IL-22釋放增加，促進(jìn)損傷黏膜愈合、抗細(xì)菌蛋白產(chǎn)生、腸道上皮細(xì)胞增生、促炎因子釋放有關(guān)。MMP-9是MMPs家族中的一員，主要來源于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，由腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生[14]。研究[2，15-16]顯示，IBD患者外周血和腸道黏膜組織中MMP-9表達(dá)增加，且與疾病活動性相關(guān)，提示MMP-9參與了IBD的發(fā)生、發(fā)展。MMP-9釋放增加可引起腸道ECM破壞，導(dǎo)致組織發(fā)生潰瘍、纖維化等器質(zhì)性變化[17]。MIF可由脂多糖、炎性細(xì)胞因子(如TNF-α、INF-γ)、缺氧等刺激產(chǎn)生，由單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、垂體細(xì)胞等釋放，可反向引起TLR4、炎性細(xì)胞因子表達(dá)，并激活T細(xì)胞，參與IBD的發(fā)生、發(fā)展。近年研究[18-19]顯示，MIF-173G/C、CATT5-8等位點多態(tài)性可能與IBD有關(guān)。國內(nèi)、外研究結(jié)果均表明，IBD患者外周血和腸道黏膜組織中MIF表達(dá)增加，且與疾病活動性相關(guān)[5,20]。

本研究證實IBD患者外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平較健康對照者顯著升高。需引起注意的是，臨床上IBD患者若合并其他易使免疫指標(biāo)發(fā)生變化的疾病，特別是易與IBD相混淆的腸結(jié)核、結(jié)腸炎、腸白塞病、腸道腫瘤等，上述指標(biāo)對診斷IBD的價值可能不高，且其在外周血中的表達(dá)無法鑒別CD與UC，需后續(xù)實驗進(jìn)一步研究。因此，筆者認(rèn)為外周血IL-22、MMP-9、MIF的檢測僅可作為診斷IBD的參考，IBD的確診仍需借助內(nèi)鏡以及活檢組織病理學(xué)檢查。此外，本研究亦證實IBD活動期患者的外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平顯著高于緩解期患者。對IBD活動期的上述三項指標(biāo)行多因素逐步Logistic回歸分析，MIF對IBD活動期的預(yù)測價值相對較小而被剔除，未進(jìn)入CD和UC活動期的整合模型，可能與三項指標(biāo)中MIF檢測的精確性最低、多因素分析平衡了混雜偏移等因素有關(guān)。IL-22、MMP-9聯(lián)合檢測的AUC大于IL-22、MMP-9、MIF各指標(biāo)單項檢測，提示聯(lián)合檢測有利于提高IBD活動期篩查的準(zhǔn)確性。由于聯(lián)合檢測的準(zhǔn)確性、特異性、敏感性均較好，因此臨床確診IBD后，可將外周血IL-22、MMP-9聯(lián)合檢測作為監(jiān)測疾病是否活動的參考指標(biāo)。相對于內(nèi)鏡檢查，其具有創(chuàng)傷小、操作簡單、易被患者接受等特點，可在臨床診療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究證實IBD患者外周血IL-22、MMP-9、MIF表達(dá)水平顯著升高，且與疾病活動性密切相關(guān)。但本研究存在病例來源均為住院患者、IBD緩解期病例相對較少、未納入疾病活動嚴(yán)重程度或其他炎癥指標(biāo)或其他腸道疾病、無法動態(tài)評估疾病變化以及治療效果等缺點，因此未來需通過擴大樣本量、納入臨床常見炎癥指標(biāo)(如C反應(yīng)蛋白)、與其他腸道疾病進(jìn)行比較、動態(tài)監(jiān)測相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平等方面對本研究結(jié)論進(jìn)行深入驗證。

參考文獻(xiàn)

1 Zhang YZ, Li YY. Inflammatory bowel disease: Pathogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20 (1): 91-99.

2 Faubion WA Jr, Fletcher JG, O’Byrne S, et al. EMerging BiomARKers in Inflammatory Bowel Disease (EMBARK) study identifies fecal calprotectin, serum MMP9, and serum IL-22 as a novel combination of biomarkers for Crohn’s disease activity: role of cross-sectional imaging[J]. Am J Gastroenterol, 2013, 108 (12): 1891-1898.

3 李莉，曹江，劉玲，等. 潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血IL-22及相關(guān)CD4+T細(xì)胞亞群的表達(dá)[J]. 中華微生物和免疫學(xué)雜志, 2012, 32 (4): 323-325.

4 Cayatte C, Joyce-Shaikh B, Vega F, et al. Biomarkers of therapeutic response in the IL-23 pathway in inflammatory bowel disease[J]. Clin Transl Gastroenterol, 2012, 3: e10.

5 張啟芳，邱小芬，張翠萍，等. 巨噬細(xì)胞移動抑制因子在炎癥性腸病發(fā)病中的作用[J]. 世界華人消化雜志, 2008, 16 (15): 1645-1648.

6 中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病學(xué)組. 炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2012, 51 (10): 818-831.

7 Xu XR, Liu CQ, Feng BS, et al. Dysregulation of mucosal immune response in pathogenesis of inflammatory bowel disease[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20 (12): 3255-3264.

8 Geremia A, Biancheri P, Allan P, et al. Innate and adaptive immunity in inflammatory bowel disease[J]. Autoimmun Rev, 2014, 13 (1): 3-10.

9 Geremia A, Jewell DP. The IL-23/IL-17 pathway in inflmmatory bowel disease[J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 2012, 6 (2): 223-237.

10Ray S, De Salvo C, Pizarro TT. Central role of IL-17/Th17 immune responses and the gut microbiota in the pathogenesis of intestinal fibrosis[J]. Curr Opin Gastroenterol, 2014, 30 (6): 531-538.

11Yang X, Zheng SG. Interleukin-22: a likely target for treatment of autoimmune diseases[J]. Autoimmun Rev, 2014, 13 (6): 615-620.

12Yu LZ, Wang HY, Yang SP, et al. Expression of interleukin-22/STAT3 signaling pathway in ulcerative colitis and related carcinogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19 (17): 2638-2649.

13Jiang WY, Su JW, Zhang X, et al. Elevated levels of Th17 cells and Th17-related cytokines are associated with disease activity in patients with inflammatory bowel disease[J]. Inflamm Res, 2014, 63 (11): 943-950.

14程倬，張文遠(yuǎn). 基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物與炎癥性腸病[J]. 實用醫(yī)院臨床雜志, 2008, 5 (6): 128-130.

15Altadill A, Eiro N, Gonzalez LO, et al. Comparative analysis of the expression of metalloproteases and their inhibitors in resected Crohn’s disease and complicated diverticular disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2012, 18 (1): 120-130.

16Lakatos G, Sipos F, Miheller P, et al. The behavior of matrix metalloproteinase-9 in lymphocytic colitis, collagenous colitis and ulcerative colitis[J]. Pathol Oncol Res, 2012, 18 (1): 85-91.

17Shi L, Ramsay S, Ermis R, et al.Invitroandinvivostudies on matrix metalloproteinases interacting with small intestine submucosa wound matrix[J]. Int Wound J, 2012, 9 (1): 44-53.

18Falvey JD, Bentley RW, Merriman TR, et al. Macrophage migration inhibitory factor gene polymorphisms in inflammatory bowel disease: An association study in New Zealand Caucasians and meta-analysis[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19 (39): 6656-6664.

19Zhang H, Ma L, Dong LQ, et al. Association of the macrophage migration inhibitory factor gene -- 173G/C polymorphism with inflammatory bowel disease: a meta-analysis of 4296 subjects[J]. Gene, 2013, 526 (2): 228-231.

20Nishihira J. Molecular function of macrophage migration inhibitory factor and a novel therapy for inflammatory bowel disease[J]. Ann N Y Acad Sci, 2012, 1271: 53-57.

(2015-01-20收稿；2015-02-08修回)

Expressions and Significance of Interleukin-22, Matrix Metalloproteinase-9 and Macrophage Migration Inhibitory Factor in Peripheral Blood of Patients with Inflammatory Bowel DiseaseZHANGChenfei1,ZHAOGuangyao1,YUZhuwen1,DAIJuan2,ZHULanxiang1,CHENWeichang1.1DepartmentofGastroenterology，theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince(215006);2DepartmentofGastroenterology,theFirstPeople’sHospitalofChangzhou,Changzhou,JiangsuProvince

Correspondence to: CHEN Weichang, Email: weichangchen@126.com

Background: The incidence of inflammatory bowel disease (IBD) is increasing recently. However, the pathogenesis has not been fully clarified. Aims: To investigate the expressions and significance of interleukin-22 (IL-22), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and macrophage migration inhibitory factor (MIF) in peripheral blood of patients with IBD. Methods: A total of 80 patients with IBD admitted from May 2011 to Nov. 2014 at the First Affiliated Hospital of Soochow University were enrolled, in which 43 cases were Crohn’s disease (CD), 37 cases were ulcerative colitis (UC).Forty healthy subjects were served as normal controls. Peripheral levels of IL-22, MMP-9 and MIF were detected by ELISA．Multivariate Logistic regression model was used to analyze IL-22, MMP-9 and MIF in active CD and UC and ROC curve was used to evaluate the diagnostic performance of these markers for screening of active CD and UC. Results: Compared with normal control group, peripheral levels of IL-22, MMP-9 and MIF increased significantly in CD and UC groups (P<0.05), while no significant difference was found between CD and UC groups (P>0.05). Peripheral levels of IL-22, MMP-9 and MIF in active CD and UC were significantly higher than those in remission stage (P<0.05). For screening of active IBD, the area under ROC curve (AUC) of combined detection of IL-22 and MMP-9 (0.853 for CD, 0.867 for UC) was superior to that of IL-22, MMP-9 or MIF only (0.747, 0.770 and 0.699 for CD, 0.774, 0.815 and 0.761 for UC). Conclusions: Peripheral levels of IL-22, MMP-9 and MIF increase markedly in IBD patients, which are correlated closely with the activity of IBD. Combined detection of IL-22 and MMP-9 might greatly increase the accuracy for screening of active IBD.

Key wordsCrohn Disease；Colitis, Ulcerative；Interleukin-22；Matrix Metalloproteinase 9；

通信作者*本文，Email: weichangchen@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.07.002