林夢(mèng)媛綜述，夏德林審校

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院頜面外科，四川瀘州646000)

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)血管化研究進(jìn)展

林夢(mèng)媛綜述，夏德林審校

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院頜面外科，四川瀘州646000)

組織創(chuàng)傷及缺損常常導(dǎo)致器官功能障礙和外形破壞，精確的修復(fù)重建在未來(lái)仍將是一個(gè)重大的醫(yī)療問(wèn)題。20世紀(jì)90年代，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix，ADM)首次成功用于皮膚缺損的修復(fù)，隨后被迅速推廣于臨床[1，2]。但是ADM僅是一種皮膚替代品，與真正的活體皮膚在結(jié)構(gòu)和功能上有非常大的差異。ADM移植后可減少瘢痕形成與色素沉著，改善受皮區(qū)創(chuàng)面愈合后的柔韌性和彈性。但與自體皮膚移植相比，真皮替代物的血管化進(jìn)程仍明顯偏慢，大大限制了ADM的臨床應(yīng)用。在治療較大面積的皮膚缺損和深度損傷時(shí)，血供問(wèn)題常常導(dǎo)致治療失敗[3]。因此，早期、快速血管化是ADM在整復(fù)外科領(lǐng)域中實(shí)現(xiàn)更好發(fā)展的保障。本文就ADM的血管化研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 ADM的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

ADM是指用化學(xué)或物理方法去除皮膚的表皮成分（角質(zhì)細(xì)胞，汗腺，皮脂腺）和真皮成分（成纖維細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞）后，保留真皮內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì),維持完整的膠原形態(tài)和基底膜的一種真皮替代物。因此其基本成分主要包括細(xì)胞外基質(zhì)、彈性蛋白、膠原成分（Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、Ⅶ型膠原）和極少量的細(xì)胞相關(guān)抗原（包括HLAABC、HLA-DR、Vimentin、Desmin、Talin等）[4]。

目前，ADM的制備方法主要有三類(lèi)：①生物學(xué)酶（胰蛋白酶，中性蛋白酶和核酸酶等）消化法;②物理學(xué)的反復(fù)凍融法（利用組織內(nèi)源性酶）;③化學(xué)去污劑法（SDS,EDTA,Triton-100等）或高滲鹽法[5]。大量研究認(rèn)為ADM植入活體后，成纖維細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)與殘存的基底膜結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，所以在ADM制作過(guò)程中，盡可能完整地保留基底膜。ADM的基底膜復(fù)合物可以形成基底膜與真皮兩個(gè)面，基底膜面可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的移行和定植，有利于ADM的上皮化，真皮面有利于快速血管化。同時(shí)，ADM中疏松有序的膠原結(jié)構(gòu)能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的良性遷移，最終完成受損組織的重構(gòu)。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，有序的膠原結(jié)構(gòu)能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，從而促進(jìn)血管生長(zhǎng)。

2 ADM的血管化研究

ADM血管化速率主要取決于移植早期能否及時(shí)獲得血漿、組織滲液的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，使周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等其它細(xì)胞因子能及時(shí)長(zhǎng)入。由于ADM去除了皮脂腺、毛發(fā)、血管、汗腺成分，具有密集的孔隙，因此植入宿主體內(nèi)后，血管內(nèi)皮能較快滲透進(jìn)去，從而實(shí)現(xiàn)血管化，為周?chē)泽w皮或自體細(xì)胞生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)，這是ADM相比其它同類(lèi)材料最大的優(yōu)勢(shì)。Kristin等[6]通過(guò)在幾內(nèi)亞豬腹部人為制造腹部切口疝，然后分別用人脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(Human acellular dermal matrix,HADM)和豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(porcine acellular dermal matrix，PADM)修復(fù)切口疝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HADM比PADM更容易與活體組織融合生長(zhǎng)，其主要原因是在移植后，前者的血管化及細(xì)胞滲透速度更快。目前ADM的血管化研究主要分為以下幾方面。

2.1 ADM的物理特性對(duì)血管化的影響

ADM孔隙的大小、密度不規(guī)則。掃描電鏡下呈現(xiàn)出凹凸不平的非連續(xù)腔隙結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)是其移植早期獲得血漿、組織滲液以及其他營(yíng)養(yǎng)因子的基礎(chǔ)。由于ADM是加工處理而成的真皮替代產(chǎn)品，其孔徑的大小與活體真皮存在差異[7]。因此，其孔徑和間距分別為多大時(shí)才最有利于血管化和組織修復(fù)，目前尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論。Burke等在膠原—氨基葡聚糖(glycosaminoglycan，GAG)膜上種植表皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，真皮支架表面孔徑小于培養(yǎng)細(xì)胞直徑(15～20 μm)，更有利于細(xì)胞生長(zhǎng)、分化。但之后的研究結(jié)論與此相反，Pruitt等[8]認(rèn)為只有ADM孔徑大于80 μm以后，周?chē)M織的內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及生長(zhǎng)因子才能順利滲透進(jìn)入ADM，從而實(shí)現(xiàn)血管化。但有一點(diǎn)是被公認(rèn)的：ADM越薄，組織液越容易滲透進(jìn)去，從而促進(jìn)血管化，反之則阻礙ADM血管化。目前商品化的ADM厚度多為0.2 mm，多數(shù)認(rèn)為在移植時(shí)自體皮片加ADM的總厚度不超過(guò)0.7 mm更有利于移植成活。

2.2 促血管生長(zhǎng)因子對(duì)ADM血管化的影響

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種非常強(qiáng)效的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)劑，具有極強(qiáng)的促進(jìn)血管增生的能力，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞在體外形成血管樣結(jié)構(gòu)。VEGF有多種同型異構(gòu)體，其中主要有VEGF 121、VEGF 165、VEGF 145、VEGF189、VEGF206等。各種VEGF異構(gòu)體都具有促進(jìn)血管再生的能力，其中VEGF165促進(jìn)血管再生的能力最強(qiáng)，在組織工程組織血管化過(guò)程中被廣泛應(yīng)用。

李菲菲等[9]將胎兒ADM包埋在SD大鼠背部皮下，實(shí)驗(yàn)組在包埋區(qū)皮下滴加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），空白組只做ADM包埋，在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)分別取材，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)在術(shù)后6周，實(shí)驗(yàn)組血管密度明顯高于空白組，預(yù)示了VEGF能在宿主體內(nèi)促進(jìn)ADM的血管化，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。賀立新等[10]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，將VEGF165基因轉(zhuǎn)染到鼠成纖維細(xì)胞后，再把此成纖維細(xì)胞接種于異種ADM表面，然后用10%的小牛血清體外培養(yǎng)1周，形成成纖維細(xì)胞—ADM的真皮替代物。在SD大鼠背部切取3 cm×4 cm的全厚皮片，將成纖維細(xì)胞一異種脫細(xì)胞真皮埋植在皮片缺損區(qū)，然后將皮片覆蓋在成纖維細(xì)胞異種脫細(xì)胞真皮表面，術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)觀察術(shù)區(qū)愈合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，成纖維細(xì)胞—ADM提高了皮片成活率，術(shù)后第4周可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組異種脫細(xì)胞真皮結(jié)構(gòu)中毛細(xì)血管數(shù)量明顯多于對(duì)照組。類(lèi)似實(shí)驗(yàn)，通過(guò)手術(shù)，在豚鼠背部造成2 cm×2 cm的全層皮膚缺損區(qū)域，然后植入ADM，表面覆蓋自體斷層皮片并縫合，在ADM深面注射囊化VEGF165—NIH3T3細(xì)胞，術(shù)后兩周，通過(guò)免疫組化方法發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組微血管密度明顯高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組皮片成活率明顯提高[11]。這些結(jié)果都說(shuō)明了VEGF在促進(jìn)ADM血管化方面有顯著效果。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)屬于FGF家族(23個(gè)已知成員)，是一種肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子。能夠促進(jìn)包括間葉細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的一系列細(xì)胞的增殖，刺激成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮管腔的形成，在體內(nèi)具有潛在的促血管生成活性。Tepper等[12]在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中利用電磁場(chǎng)的作用促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌出bFGF,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示bFGF能促進(jìn)血管生長(zhǎng)和形成。此外，bFGF在傷口愈合和組織修復(fù)中發(fā)揮著重要。但是目前還未見(jiàn)bFGF運(yùn)用在ADM的相關(guān)研究。

2.3 血管化種子細(xì)胞對(duì)ADM血管化的影響

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC)和血管內(nèi)皮細(xì)胞是最終分化為血管的主要細(xì)胞[13,14]。研究認(rèn)為，能分化為血管的EPC表面標(biāo)記物主要有CD31，CD34,Tie-2。在正常情況下EPC保持低增殖活性，在組織損傷后，EPC能分化形成血管等新的組織結(jié)構(gòu)。進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(circulating endothelial progenitor,CEP)具有較高的增殖潛能，研究證實(shí)，在四肢缺血、心肌缺血，視網(wǎng)膜缺血以及胰腺缺血后，體內(nèi)應(yīng)用CEP能有效促進(jìn)損傷區(qū)血管生長(zhǎng)[15-17]。因此，ECP和CEP在組織工程血管化方面的應(yīng)用具有潛在價(jià)值，但目前沒(méi)有將二者用于ADM的相關(guān)報(bào)道。

早在1998年，Black等[18]將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在膠原粘多糖（collagen-glycosaminoglycan）高分子聚合物支架上，成功誘導(dǎo)支架內(nèi)皮化。隨后，Supp等[3]通過(guò)基因改造，讓角質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）后，將其種植在皮膚替代物表面，然后將皮膚替代物移植在裸鼠皮下，結(jié)果顯示其促進(jìn)了皮膚替代物血管化。為了解決異體細(xì)胞引起的排斥反應(yīng)，Sahota等[19]從需要皮膚修復(fù)手術(shù)的患者體表取下少量皮膚組織，運(yùn)用膠原酶消化法分離出微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human dermal microvascular endothelial cells，HuDMECs）、角化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞后，在體外環(huán)境中讓三者同時(shí)生長(zhǎng)黏附在人ADM材料上，形成ADM復(fù)合物，然后將ADM復(fù)合物進(jìn)行自體移植。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)：在體外培養(yǎng)2周左右，HuDMECs滲透入ADM的量最合適，即適合移植入活體，術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)移植的ADM復(fù)合物生長(zhǎng)良好，修復(fù)效果滿意。將人內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)在二維培養(yǎng)基中，容易喪失其分化潛能，為了觀察內(nèi)皮細(xì)胞早期管狀出芽情況，Wenger等[20]將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞混合培養(yǎng)于膠原支架上，使其生長(zhǎng)形成類(lèi)球體，最終誘導(dǎo)出新生血管，使膠原支架血管化。2003年王軍琳等[21]通過(guò)在ADM材料上培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞加速了ADM血管化。汪道新等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)，在豬的背側(cè)剃毛后，切除皮膚全層，手術(shù)造成大小為5 cm×5 cm的圓形皮膚缺損區(qū)域，然后植入ADM，在ADM下方注射人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液1 mL，約含細(xì)胞2×106個(gè)，其上覆蓋自體皮膚后封閉傷口，術(shù)后7 d發(fā)現(xiàn)術(shù)區(qū)血管化數(shù)目明顯多于對(duì)照組。楊家驥等[23]用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合豬ADM構(gòu)建出富含血管化結(jié)構(gòu)的真皮替代物，然后移植在裸鼠皮下，移植后3周，HE結(jié)果顯示，對(duì)照組無(wú)血管形成，而實(shí)驗(yàn)組有大量血管樣結(jié)構(gòu)形成。臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)在ADM材料上，制成ADM復(fù)合物，然后移植在裸鼠背部皮膚下，作者用自制的極低頻電磁刺激儀分別在體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩個(gè)階段刺激ADM復(fù)合物上面的細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)極低頻電磁場(chǎng)不僅促進(jìn)成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系形成血管結(jié)構(gòu)，并且促進(jìn)與宿主血管相吻合。因此，在體外構(gòu)建出由ADM復(fù)合人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞含血管樣結(jié)構(gòu)的組織工程真皮，能在移植進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后提高修復(fù)區(qū)組織的血管形成速度，進(jìn)而提高移植成功率，極低頻電磁場(chǎng)能有效促進(jìn)這一過(guò)程[24]。雖然這類(lèi)方法目前取得了一定進(jìn)展，但是血管內(nèi)皮細(xì)胞在支架材料上存活較低、易凋亡，因此，仍然需要進(jìn)一步探索更為有效的ADM血管化方法。

3 展望

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)在臨床應(yīng)用中，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)血管化是ADM移植是否成活的關(guān)鍵。因此，充分理解ADM在體內(nèi)、體外血管化的具體機(jī)制，有利于進(jìn)一步探索新的促進(jìn)ADM血管化的策略，提高它在活體移植的成功率。雖然ADM已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，但它畢竟是一種缺乏活體細(xì)胞的真皮替代產(chǎn)品，要實(shí)現(xiàn)與活體組織的完美融合，甚至實(shí)現(xiàn)活體皮膚的功能，仍然有很多問(wèn)題需要解決。首先應(yīng)該進(jìn)一步探索材料的孔徑大小及孔徑密度，以使血管化達(dá)到最佳。同時(shí)優(yōu)化ADM的制作方法、開(kāi)發(fā)新的打孔技術(shù)，使材料的物理特性和生物學(xué)特性更符合血管化要求。第二方面，進(jìn)一步探索ADM血管化的分子機(jī)制，尋找新的蛋白或基因調(diào)控靶點(diǎn)，從而建立新的促血管化方法。除此之外，3D生物打印技術(shù)是目前新興的學(xué)科，根據(jù)已有報(bào)道，它已經(jīng)成功應(yīng)用于修復(fù)外科領(lǐng)域，特別是骨骼、皮膚修復(fù)方面[25-27]。應(yīng)用這個(gè)手段，結(jié)合細(xì)胞生物技術(shù)、高分子材料技術(shù)，將來(lái)可能會(huì)在組織修復(fù)，包括ADM血管化方面有所突破[28]。本文通過(guò)歸納目前實(shí)現(xiàn)ADM血管化的主要方法和相應(yīng)進(jìn)展，旨在為ADM血管化相關(guān)研究提供線索和思路。

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（2014-10-10收稿）

R783.9

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.02.030

林夢(mèng)媛（1987-），女，住院醫(yī)師，碩士研究生，E-mail：497313477@qq.com