劉億綜述，徐亮審校

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，四川瀘州646000）

結(jié)直腸癌體外藥敏與多藥耐藥基因表達(dá)的相關(guān)性研究進(jìn)展

劉億綜述，徐亮審校

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，四川瀘州646000）

大腸癌是我國最常見的消化系惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年增加，病死率居高不下。手術(shù)是重要的治療方法，然而單純手術(shù)的療效相當(dāng)有限?；熣紦?jù)越來越重要的地位，但是目前療效仍不理想，其主要原因是存在腫瘤的多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）。腫瘤是一個(gè)異質(zhì)性、多態(tài)性、分化不均的細(xì)胞群體，同一組織類型的腫瘤對同一藥物的敏感性存在著差異，腫瘤化療效果會(huì)受到嚴(yán)重影響。因此，為了提高化療效果和避免多藥耐藥的產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)對患者的個(gè)體化治療，個(gè)體腫瘤藥敏試驗(yàn)顯得越來越來重要。本文就腫瘤體外藥敏試驗(yàn)與多藥耐藥基因表達(dá)的相關(guān)性研究進(jìn)展做一綜述。

1 惡性腫瘤體外藥敏試驗(yàn)研究進(jìn)展

1.1 體外藥敏試驗(yàn)的概述

體外藥敏試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室條件下檢測腫瘤標(biāo)本對選擇性給予的化療藥物的藥物反應(yīng)，通常以腫瘤的生存是否受到抑制作為衡量敏感或者耐藥的標(biāo)準(zhǔn)[1]。一個(gè)理想的體外藥敏檢測方法應(yīng)該具備以下特點(diǎn)：①所需腫瘤組織少；②標(biāo)本可評價(jià)率高；③結(jié)果具有較好的重復(fù)性；④體外試驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)治療反應(yīng)一致性高；⑤操作流程標(biāo)準(zhǔn)化和評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化，結(jié)果判定可靠、客觀；⑥具備產(chǎn)業(yè)化條件[2]。1953年Black和Gree LA首先報(bào)道了癌標(biāo)本的體外藥敏試驗(yàn)[3]。而后伴隨著腫瘤化療藥物的不斷增加及腫瘤化療的不斷發(fā)展，腫瘤體外藥敏試驗(yàn)隨之發(fā)展起來。

1.2 體外藥敏試驗(yàn)的常用方法

上世紀(jì)70年代后期Salmon和Hamburger首先建立了適宜人腫瘤原代細(xì)胞生長的雙層軟瓊脂培養(yǎng)系統(tǒng)，既腫瘤干細(xì)胞克隆分析（human tumor cloning assay，HTCA），為抗癌藥物敏感試驗(yàn)的發(fā)展打下了基礎(chǔ)。1983年Mosmann[4]首創(chuàng)四氮唑鹽比色法（MTT法），這種方法最初用于研究IL-22等細(xì)胞因子對鼠淋巴瘤細(xì)胞系存活和增殖作用的影響，近年來MTT法因其簡單、快速、靈敏等特點(diǎn)被廣泛用于臨床。20世紀(jì)70年代報(bào)道了三磷酸腺苷生物熒光法（ATP-TCA），該技術(shù)的基本原理是熒光酶在有氧條件下，可以和熒光素結(jié)合后催化三磷酸腺苷（ATP）轉(zhuǎn)變成AMP（磷酸腺苷），同時(shí)釋放出熒光（波長562 nm），所釋放的熒光強(qiáng)度與ATP含量呈正相關(guān)[5]。上世紀(jì)80年代，還產(chǎn)生了較多的檢測方法包括：胸腺嘧啶摻入法（H3-t）、細(xì)胞毒差別染色檢測法（DISC）、流式細(xì)胞儀法（FCM）等，它們統(tǒng)稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)法，這種方法雖然有簡單實(shí)用、適用腫瘤類型廣、可體外大量擴(kuò)增等優(yōu)勢，但是它破壞了腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的環(huán)境，導(dǎo)致結(jié)果與臨床實(shí)際存在一定差別。90年代以來，更多研究者開始努力尋找一種培養(yǎng)腫瘤的環(huán)境，這種環(huán)境能真實(shí)反映體內(nèi)腫瘤生長情況。于是單層細(xì)胞培養(yǎng)的藥敏試驗(yàn)開始向三維培養(yǎng)發(fā)展。80年代末Hoffman創(chuàng)立了三維立體組織培養(yǎng)法（HDRA法），這種方法將新鮮的腫瘤標(biāo)本制成約含100～200個(gè)細(xì)胞、大小約1～2 mm3的微小團(tuán)塊，加入有助于貼壁的基質(zhì)和無血清復(fù)合培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后加抗癌藥繼續(xù)培養(yǎng)72 h染色記數(shù)[6-7]。這些藥敏檢測方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，目前還沒有一個(gè)完全理想的方法，能真正實(shí)現(xiàn)體內(nèi)外完全一致。

2 結(jié)直腸癌多藥耐藥基因研究進(jìn)展

目前化療在結(jié)直腸癌中的地位越來越明顯，但是化療效果一直不明顯，一個(gè)主要原因是多藥耐藥（MDR），多藥耐藥現(xiàn)象是指腫瘤細(xì)胞一旦對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，對其他結(jié)構(gòu)和功能不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥。目前研究認(rèn)為[8]多藥耐藥主要有幾種機(jī)制：①耐藥相關(guān)蛋白異常表達(dá)；②MDR酶活性改變；③凋亡抑制；④轉(zhuǎn)錄因子的激活等。

2.1 耐藥相關(guān)蛋白的異常表達(dá)

P-糖蛋白（P-gp）目前P-糖蛋白在多藥耐藥研究中最為重要、研究最為深入。P-gp也稱P170糖蛋白，因?yàn)樗南鄬Ψ肿淤|(zhì)量為170×103，它是1976年Juliano和Ling在研究對秋水仙堿耐藥的中國倉鼠卵巢細(xì)胞（chinese hamster ovary，CHO）時(shí)發(fā)現(xiàn)[9]。P-gp由1280個(gè)氨基酸組成，是一種ATP依賴跨膜糖蛋白，由MDR1（multidrug resistance1）基因編碼表達(dá)。目前研究認(rèn)為[10]，p-gp耐藥的機(jī)制主要是它的藥物泵作用，通過這個(gè)泵將多種藥物泵出細(xì)胞外，使胞內(nèi)藥物減少。MDR1mRNA在機(jī)體很多組織中均有表達(dá)，但是MDR表型的腫瘤細(xì)胞中，MDR1/P-gp存在過度表達(dá)，并且大腸癌是表達(dá)水平及頻率最高的腫瘤之一[11]。Emdad等[12]利用腺病毒將黑色素瘤分化相關(guān)基因-7轉(zhuǎn)入p-gp介導(dǎo)的人結(jié)直腸癌多藥耐藥細(xì)胞株SW620/Dox后，大大提高了對化療藥物的敏感性。

多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）研究最多的是MRP1，它也是一種ATP依賴的MDR相關(guān)的藥物泵，是繼P-gp之后發(fā)現(xiàn)的第2個(gè)ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，相對分子質(zhì)量190 kD，又稱ABCC1，在20世紀(jì)90年代由Cole等在研究阿霉素耐藥的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)的。MRP1與p-gp在結(jié)構(gòu)和功能上有許多相似，主要分布于細(xì)胞膜，定位于高爾基體、細(xì)胞囊泡等處。與p-gp介導(dǎo)的MDR的主要不同在于耐藥譜差異，常合并有谷胱甘肽（GSH）活性升高，它能識別和轉(zhuǎn)運(yùn)與GST耦合的底物，故又稱為GSH-X泵[13]。

除此之外，目前研究的較多的還有乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白（breast cancer resistance protein,BCRP）/ABCG2及肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistance protein,LRP)等。

2.2 MDR酶活性的改變

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S transferases，GST）是一個(gè)同源二聚體酶的超基因家族，普遍存在于各種生物體內(nèi)。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了α、π、θ、μ和ζ5個(gè)亞型，其中存在于細(xì)胞質(zhì)中的有α、μ、π、θ四個(gè)亞型[14]。其中GST-π在腫瘤細(xì)胞系中分布最廣，約占據(jù)90%，它在人類多種腫瘤組織中均有高表達(dá)，與結(jié)直腸癌關(guān)系非常密切[15]。GST-π為一組二聚體蛋白質(zhì)，是一種關(guān)鍵酶，它主要存在于細(xì)胞液中，能在谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)中催化該反應(yīng)的啟動(dòng)，藥物產(chǎn)生的過氧化物可被它還原為無毒物質(zhì)。特別是某些抗癌藥物與GSH結(jié)合，增加其水溶性，加速其通過尿液與膽汁排泄，從而使體內(nèi)細(xì)胞藥物濃度下降而降低藥物的療效，最終使該類化療藥物產(chǎn)生耐藥。沈金輝等[16]利用免疫組織化學(xué)S-P法研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織中GST-π的表達(dá)明顯高于結(jié)腸正常組織，可見，GST-π可以協(xié)助結(jié)直腸癌的診斷。

拓?fù)洚悩?gòu)酶研究發(fā)現(xiàn)Topo有2種類型TopoⅠ和TopoⅡ，其中TopoⅡ參與真核細(xì)胞DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和染色體分離等過程，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA合成、提高腫瘤的增殖能力[17]。因此，結(jié)直腸癌的多藥耐藥與TopoⅡ活性的降低或者其含量的減少有直接關(guān)系。

3 臨床意義

經(jīng)過一系列的研究，對惡性腫瘤體外藥敏試驗(yàn)研究進(jìn)展，以及對結(jié)直腸癌多藥耐藥機(jī)制有了初步了解，目前國內(nèi)外正在對二者之間的相關(guān)性作進(jìn)一步研究。袁庶強(qiáng)等[18]利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)和免疫組織化學(xué)法測定結(jié)直腸癌組織中MDR1、MRP1、ABCG2基因蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)基因和蛋白的表達(dá)無相關(guān)性，同時(shí)利用三維培養(yǎng)體外藥敏試驗(yàn)檢測表阿霉素、順鉑、草酸鉑、5-FU、泰帝素、伊立替康6種単藥和5-FU+表阿霉素、5-FU+伊立替康、5-FU+草酸鉑、5-FU+泰帝素+順鉑4組聯(lián)合用藥的抑制率和敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，単藥組中抑制率和敏感性最高者均為5-FU，聯(lián)合用藥中5-FU+奧沙利鉑最高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，MDR1、MRP1、ABCG2蛋白高表達(dá)與腫瘤對表阿霉素耐藥有相關(guān)性。韓杰等[19]利用MTT法對胃癌、大腸癌行體外藥敏測定，并利用免疫組織化學(xué)法初步探測了耐藥基因與藥敏之間的相關(guān)性。經(jīng)過研究它們的相關(guān)性，這對手術(shù)患者術(shù)后化療確實(shí)有很好的指導(dǎo)作用。然而，對不需或不愿手術(shù)的患者進(jìn)行耐藥蛋白的檢測，是否可以直接通過外周血液進(jìn)一步檢測耐藥基因蛋白，侍作亮等[20]利用熒光定量聚合聚合酶聯(lián)反應(yīng)（FQ-PCR）法檢測原發(fā)性肝癌外周血有核細(xì)胞與術(shù)后腫瘤標(biāo)本中MDR1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外周血MDR1基因表達(dá)的結(jié)果與肝癌細(xì)胞MDR1的表達(dá)明顯相關(guān)，即可以通過外周血行肝癌耐藥基因的檢測，那么我們也可以用同樣的方法檢測結(jié)直腸癌的耐藥基因。

4 問題與展望

結(jié)直腸癌的異質(zhì)性、多態(tài)性及分化不均等導(dǎo)致了MDR機(jī)制的復(fù)雜性，呈現(xiàn)出多機(jī)制、多因素的特點(diǎn)，特別是MDR與化療藥物之間深層次的聯(lián)系更加復(fù)雜。通過研究，它有利于我們進(jìn)一步明確結(jié)直腸癌多藥耐藥機(jī)制以及與腫瘤藥敏之間的關(guān)系，指導(dǎo)臨床醫(yī)生了解腫瘤患者耐藥基因的表達(dá)情況，可以預(yù)測腫瘤對化療的反應(yīng)程度，制定合理的化療方案，真正實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。然而，目前對結(jié)直腸癌多藥耐藥的研究只是冰山一角，還需要進(jìn)一步研究，特別是多藥耐藥基因蛋白的分子機(jī)制及內(nèi)在聯(lián)系；另一方面，我們可以進(jìn)一步研發(fā)更先進(jìn)的藥敏檢測技術(shù)，真正實(shí)現(xiàn)體內(nèi)外藥敏的一致性。

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（2014-11-26收稿）

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A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.02.031

劉億（1986-），男，碩士生，E-mail：516155767@qq.com