張強(qiáng) （安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蚌埠233100）

食品安全問(wèn)題不僅會(huì)影響廣大人民群眾的身體健康和生命安全，而且還制約著整個(gè)國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。然而，當(dāng)下的食品安全問(wèn)題形勢(shì)嚴(yán)峻，問(wèn)題頻發(fā)，三聚氰胺、蘇丹紅、致癌毒米、阜陽(yáng)大頭娃娃奶粉以及瘦肉精等數(shù)十起食品安全事件被曝光后，引起了人們的極大關(guān)注［1］。目前，應(yīng)用于食品安全檢測(cè)的技術(shù)有儀器檢測(cè)法、化學(xué)分析檢測(cè)法、免疫分析檢測(cè)法、定性、定量、在線監(jiān)測(cè)檢測(cè)法等［2］。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）作為一種免疫分析檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)便、有效、特異性強(qiáng)、靈敏度高、不需要昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物殘留、重金屬污染、生物毒素、食品添加劑檢測(cè)等諸多方面［3，4］。筆者對(duì)ELISA技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并就其在應(yīng)用中存在的不足及發(fā)展趨勢(shì)和應(yīng)用前景進(jìn)行了探討，旨在進(jìn)一步促進(jìn)該技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用和推廣。

1 ELISA技術(shù)簡(jiǎn)介

ELISA技術(shù)是一種將抗原、抗體免疫反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性有機(jī)地結(jié)合起來(lái)的一種非放射性應(yīng)用型檢測(cè)方法。ELISA技術(shù)的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗體或抗原的酶標(biāo)記，其基本原理包括：抗體 （抗原）吸附在固相載體的外表面，并維持抗體 （抗原）的免疫活性；抗體 （抗原）能通過(guò)共價(jià)鍵來(lái)與酶連接而形成酶復(fù)合物，并維持原有的免疫學(xué)和酶學(xué)活性；酶復(fù)合物與對(duì)應(yīng)的抗體 （抗原）結(jié)合后，可根據(jù)加入底物后的顏色改變來(lái)判定試驗(yàn)結(jié)果［5］。

ELISA技術(shù)可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在測(cè)定過(guò)程中有3個(gè)必要的試劑，即固相的抗原或抗體 （免疫吸附劑）、酶標(biāo)記的抗原或抗體 （結(jié)合物）和酶反應(yīng)的底物。根據(jù)這些試劑結(jié)合方式的不同，ELISA技術(shù)主要分為直接法、間接法、雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法等幾種不同應(yīng)用類(lèi)型［6］。

2 ELISA在食品安全性檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 生物毒素檢測(cè)

生物毒素也稱(chēng)為天然毒素，是生物體分泌代謝或半生物合成產(chǎn)生的、不可自復(fù)制的有毒化學(xué)物質(zhì)。目前，已發(fā)現(xiàn)的的生物毒素有數(shù)千種，依據(jù)來(lái)源可以把生物毒素分為微生物毒素、植物毒素和動(dòng)物毒素［7］。存在于食物中的毒素往往會(huì)引起食物中毒、胃腸炎、溶血性貧血甚至癌癥等威脅人類(lèi)健康的疾病，其在食品中的含量在每個(gè)國(guó)家都具有嚴(yán)格控制標(biāo)準(zhǔn)［8］。黃曲霉毒素B1是黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)、危害最大的一種［9］。劉蓉等［10］利用基因工程手段制備了黃曲霉毒素B1的單鏈抗體，將其用于ELISA檢測(cè)方法以檢測(cè)醬油中黃曲霉毒素B1的含量，其檢測(cè)限為0.10ng／mL，平均加標(biāo)回收率在84%～109%之間；肖智等［11］將黃曲霉毒素B1轉(zhuǎn)化為半縮醛B2a，再以B2a為半抗原通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備了黃曲霉毒素B1高特異性單克隆抗體，通過(guò)ELISA技術(shù)對(duì)黃曲霉毒素B1的檢測(cè)限為 （0.6±0.078）ng／mL，抗體與其他黃曲霉毒素的交叉反應(yīng)率顯著降低；Wang等［12］建立了基于多克隆抗體檢測(cè)黃曲霉毒素M1的ELISA快速分析方法，該法檢測(cè)限為1.0ng／mL。目前，ELISA技術(shù)除了應(yīng)用于食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)外，還在脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （DON）、赤霉烯酮 （ZEN）等其他真菌毒素［13］及河豚毒素、蓖麻毒素和苦馬豆素等動(dòng)物和植物源毒素［14］檢測(cè)方面得到了廣泛的應(yīng)用，并均取得了較理想的效果，表明該法在食品毒素檢測(cè)方面大有潛力可挖，值得進(jìn)一步應(yīng)用。

2.2 致病微生物檢測(cè)

病原微生物可引起食源性疾病，是食品生物性污染的重要因素，也是影響食品安全的主要因素之一。傳統(tǒng)的病原微生物學(xué)檢查以染色、培養(yǎng)、生化鑒定等為主，將標(biāo)本直接涂片染色鏡檢和接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)是對(duì)細(xì)菌或真菌感染性疾病進(jìn)行病原學(xué)診斷的常用方法［15］。這些常規(guī)方法需要大量的手工勞動(dòng)，檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，對(duì)特征菌落的判定受主觀因素影響較大，容易漏檢，無(wú)法滿足現(xiàn)代對(duì)微生物快速檢測(cè)的需要，而ELISA技術(shù)在這方面具有一定優(yōu)勢(shì)。目前，已有許多研究者借助ELISA技術(shù)建立了食品中有害菌的檢測(cè)方法。李建科等［16］建立了果汁中耐熱菌的間接性ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)限為5×104CFU／mL，檢測(cè)時(shí)間比目前國(guó)內(nèi)外普遍采用的美國(guó)庫(kù)克食品實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)法縮短3～4d；張顯昱等［17］建立了能夠快速檢測(cè)樣品中鮰愛(ài)德華菌的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，該方法對(duì)鮰愛(ài)德華菌的最低檢測(cè)量為1×106cells／mL，具有良好的靈敏性和特異性；伍燕華等［18］建立了快速檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的雙抗夾心ELISA方法，該法最低檢測(cè)量為1×104CFU／mL，與其他雜菌不存在交叉反應(yīng)，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的沙門(mén)氏菌。目前，ELISA法可用于檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌、軍團(tuán)菌、假單胞菌屬、大腸桿菌O－157、致賀氏菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和臘樣芽抱桿菌等多種致病微生物，在病原微生物檢測(cè)方面具有很大的發(fā)展空間。

2.3 重金屬污染檢測(cè)

隨著環(huán)境污染的日益加劇，食品原料或成品的重金屬污染也日趨嚴(yán)重，如何快速、有效地檢測(cè)出受重金屬污染的食品迫在眉捷。傳統(tǒng)的重金屬檢測(cè)方法有原子吸收光譜法、X射線熒光光譜法、電感耦合等離子發(fā)射光譜法 （ICP－AES）等，該類(lèi)方法準(zhǔn)確、敏感，但儀器較昂貴，操作復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)的工作人員，不適于大規(guī)模快速普查。近年來(lái)，ELISA技術(shù)在食品中重金屬檢測(cè)方面得到了迅速發(fā)展。郭常偉等［19］建立了樣品中銅離子的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法。該法最低檢測(cè)限為2.0ng／mL，與ICPAES法檢測(cè)結(jié)果的總符合率超過(guò)94%；方淑兵等［20］建立了重金屬汞離子的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA分析方法，該法檢測(cè)限為0.45μg／L，靈敏度為4.10μg／L，與其他金屬均無(wú)明顯交叉反應(yīng)，與電感耦合等離子體質(zhì)譜 （ICP－MS）法檢測(cè)結(jié)果具有很好的相關(guān)性 （相關(guān)系數(shù)為0.988）；楊依錦等［21］建立了重金屬鉛的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，最低檢出限為0.32ng／mL，與ICP－MS法檢測(cè)結(jié)果的總符合率超97%；王津等［22］建立了樣品中鎘離子的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)法，其檢測(cè)限為0.76μg／L，與其他金屬螯合物的交叉反應(yīng)率均低于1.32%。上述研究結(jié)果表明，ELISA法具有較高的準(zhǔn)確性，適用于樣品中重金屬的快速篩選和檢測(cè)。

2.4 農(nóng)藥殘留檢測(cè)

自1983年以來(lái)，ELISA技術(shù)已成為國(guó)際上分析農(nóng)藥殘留的首選方法，目前已廣泛用于有機(jī)磷類(lèi)、有機(jī)氯類(lèi)、除蟲(chóng)菊酯、磺胺類(lèi)等農(nóng)藥殘留的檢測(cè)［23］。方松等［24］建立了基于多克隆抗體的氯噻啉間接競(jìng)爭(zhēng)酶性ELISA分析方法，該方法的最低檢測(cè)限為1.8μg／L，所得多克隆抗體除與吡蟲(chóng)啉有較大的交叉反應(yīng)外，與其他結(jié)構(gòu)相似的化合物無(wú)明顯交叉反應(yīng)；余鵬敏等［25］建立了樣品中乙草胺含量的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)法，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測(cè)限為24.4μg／L，與結(jié)構(gòu)相似的其他農(nóng)藥無(wú)明顯交叉反應(yīng)，適合環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中乙草胺的檢測(cè)；韋倩妮等［26］建立了有機(jī)磷農(nóng)藥三唑磷的間接性ELISA檢測(cè)法，該方法最低檢測(cè)限為1.0μg／L，定量檢測(cè)線性范圍為2.5～100.0μg／L，具有高度的特異性，與其他有機(jī)磷農(nóng)藥結(jié)構(gòu)類(lèi)似物無(wú)明顯交叉反應(yīng)。目前，許多國(guó)家已開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的ELISA檢測(cè)試劑盒，可用于直接檢測(cè)果蔬等植物性食品中的農(nóng)藥殘留。

2.5 獸藥殘留檢測(cè)

食品中獸藥殘留是影響世界各國(guó)食品安全的主要因素。食品中獸藥殘留主要包括抗生素類(lèi)、激素藥類(lèi)、抗球蟲(chóng)類(lèi)、呋喃藥類(lèi)、磺胺藥類(lèi)和驅(qū)蟲(chóng)藥類(lèi)藥物。目前，關(guān)于動(dòng)物性食品獸藥殘留檢測(cè)中ELISA法的應(yīng)用已取得顯著成效。楊君宏等［27］建立了一種檢測(cè)牛組織中阿維菌素類(lèi)藥物 （Avermectins，AVMs）殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法，該法可同時(shí)檢測(cè)牛肝臟和肌肉中阿維菌素、伊維菌素和埃普里諾菌素殘留，檢測(cè)限為1.1ng／mL；姜金慶等［28］建立了樣品中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.1ng／mL，該法對(duì)恩諾沙星、諾氟沙星和培氟沙星均能特異性識(shí)別；王鶴佳等［29］建立雞肉中尼卡巴嗪殘留的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，在雞肉中檢測(cè)限為9.2μg／kg，在精密度、靈敏度和準(zhǔn)確度方面均能滿足獸藥殘留篩選檢測(cè)要求。上述研究結(jié)果表明，隨著ELISA技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，其在動(dòng)物性食品中獸藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用前景將十分廣闊。

2.6 轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)

隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品種類(lèi)和數(shù)量的不斷增多，轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的安全性也越來(lái)越受到人們關(guān)注，越來(lái)越多的國(guó)家要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行標(biāo)簽制度，這就對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)提出了更高的要求。目前，ELISA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)。顧煒煒等［30］研制了用于檢測(cè)轉(zhuǎn)Btcry2Ab／2Ac殺蟲(chóng)蛋白基因食品的直接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA試劑盒，最低檢測(cè)限為40ng／mL，可用于轉(zhuǎn)基因食品的快速、批量檢測(cè)；朱振營(yíng)等［31］建立了轉(zhuǎn)基因牛奶及奶制品中人乳鐵蛋白的夾心ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.25×10－3g／L；劉志浩等［32］建立了檢測(cè)轉(zhuǎn)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因玉米的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，并與傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR）檢測(cè)法進(jìn)行比較，2種檢測(cè)方法的符合率為100%，確定了該方法的準(zhǔn)確性和可靠性；Guerler等［33］建立了轉(zhuǎn)CryAb蛋白基因食品的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法，對(duì)CrylAb蛋白的分析檢測(cè)限為0.4ng／mL，檢測(cè)特異性?xún)?yōu)于實(shí)時(shí)熒光PCR，證實(shí)了ELISA技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)中具有可利用性。

2.7 過(guò)敏原的檢測(cè)

食品的過(guò)敏反應(yīng)已成為人類(lèi)生活中普遍存在的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題，引起了人們的廣泛關(guān)注。建立有效的食品過(guò)敏原檢測(cè)方法是過(guò)敏原安全管理的技術(shù)保障。目前ELISA技術(shù)是除PCR反應(yīng)以外的另一種非常重要的檢測(cè)方法。張潔瓊等［34］建立了杏仁過(guò)敏原苦杏仁球蛋白的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，該法對(duì)甜杏仁中苦杏仁球蛋白的檢測(cè)限為 （6.36±1.02）μg／L，與常見(jiàn)的14種植物性蛋白沒(méi)有交叉反應(yīng)；談超等［35］建立了綠豆過(guò)敏原蛋白間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，該法檢出限為 （0.72±0.035）μg／mL；吉坤美等［36］建立了食物中花生過(guò)敏原蛋白的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法，該法特異性強(qiáng)，其最低檢出限為8ng／mL。上述研究表明ELISA技術(shù)是一種實(shí)用、靈敏、特異性強(qiáng)的食品中過(guò)敏原的檢測(cè)方法。

2.8 食品中違法添加的非食用物質(zhì)的檢測(cè)

違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑是導(dǎo)致食品質(zhì)量安全問(wèn)題的重要原因之一。近年來(lái)出現(xiàn)的如瘦肉精、三聚氰胺以及蘇丹紅等食品安全事件，反映出當(dāng)前在食品生產(chǎn)和加工過(guò)程中濫用食品添加劑和違法添加非食用物質(zhì)的問(wèn)題十分嚴(yán)重。因此，ELISA技術(shù)作為一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)以及快速的檢測(cè)方法對(duì)于食品中違法添加劑的分析檢測(cè)尤為重要。王黎麗等［37］建立了基于單克隆抗體的三聚氰胺間接和直接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，2種檢測(cè)法的檢測(cè)限分為0.079μg／L和0.12μg／L；郭杰標(biāo)等［38］建立了保健酒中非法添加雙氯芬酸的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，其最低檢出限為2.0ng／mL，與8種相關(guān)藥物交叉反應(yīng)率都小于0.1%。范祚舟［39］建立了一種能夠快速檢測(cè)食品中蘇丹紅的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)法，對(duì)于蘇丹紅I檢測(cè)的IC50為0.34ng／mL；汪惠澤［40］建立了樣品中鹽酸克倫特羅的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，該法檢測(cè)限低于0.5ng／mL，交叉實(shí)驗(yàn)表明，該法具有高度的特異性，與其他一些P－腎上腺素激動(dòng)劑藥物無(wú)交叉反應(yīng)。

3 ELISA技術(shù)存在的主要問(wèn)題

與其他分析檢測(cè)技術(shù)相比，ELISA技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于特異性強(qiáng)、靈敏度高、測(cè)定成本低、樣品處理量大、對(duì)儀器設(shè)備要求不高、方法快速簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高、無(wú)放射性同位素污染等，但其在食品安全檢測(cè)的應(yīng)用過(guò)程中也存在著一些問(wèn)題。首先，該方法需要較多的儀器設(shè)備，如酶標(biāo)儀、冰箱及恒溫箱等，不適宜基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。其次抗體制備較困難。一方面，一些單克隆抗體制備的時(shí)間較長(zhǎng) （至少2個(gè)月），另一方面有些被檢測(cè)樣品分子量小，必須與BSA等大分子蛋白質(zhì)偶聯(lián)后才具備免疫原性，而且并非所有的小分子被檢樣品都能制備出用于免疫分析的抗體，因?yàn)槠涫茉撐镔|(zhì)的結(jié)構(gòu)和載體蛋白的連接位置等多種因素的影響。再次，對(duì)與待檢樣品結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，將導(dǎo)致定量檢測(cè)準(zhǔn)確度降低。此外，由于食品的樣本類(lèi)型復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)可能抑制免疫結(jié)合反應(yīng)。不同待測(cè)樣品性質(zhì)各異，處理方法存在許多不確定性，同時(shí)抗體特異性和穩(wěn)定性對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響機(jī)制尚不清楚，影響其特異性和穩(wěn)定性的因素還不是很明確，使得不確定因素增多且不易控制，難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。

4 ELISA技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)與應(yīng)用前景

目前，ELISA技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，伴隨科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，該技術(shù)必將產(chǎn)生新的發(fā)展趨勢(shì)，具體內(nèi)容如下：開(kāi)發(fā)具有高度免疫性的重組抗原來(lái)代替無(wú)法分離的原始抗原物質(zhì)以提高其免疫原性；將酶體外定向進(jìn)化應(yīng)用到檢測(cè)中 （一種同時(shí)具有催化底物顯色反應(yīng)的酶活性和特異性抗體或抗原性質(zhì)的融合蛋白），避免酶與特異性抗體或抗原的化學(xué)交聯(lián)過(guò)程，從而大大地提高檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性；加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)化，促進(jìn)商品化的應(yīng)用；與其他檢測(cè)方法如PCR、色譜技術(shù)等相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，擴(kuò)大其優(yōu)勢(shì)、改善弊端。隨著研究的不斷深入，相信ELISA技術(shù)的應(yīng)用范圍會(huì)越來(lái)越廣，檢測(cè)限會(huì)越來(lái)越低，穩(wěn)定性越來(lái)越強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)間越來(lái)越短，費(fèi)用越來(lái)越低，ELISA技術(shù)在未來(lái)食品安全的快速檢測(cè)中將發(fā)揮更加突出和重要的作用，從而使食品安全檢測(cè)技術(shù)愈加精確、簡(jiǎn)單、方便。

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