汪佳婕 寶福凱，2，3，4，5 柳愛(ài)華

1.昆明醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)系 熱帶醫(yī)學(xué)研究所，云南昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)云南省高校熱帶傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500；3.云南省熱帶病示范型國(guó)際科技合作基地，云南昆明 650500；4.云南省公共衛(wèi)生與疾病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，云南昆明 650500；5.昆明醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，云南昆明 650500

萊姆?。↙yme disease）作為一種蜱媒傳播的傳染性疾病， 在一些特殊人群和一些特別地區(qū)有很高的感染率。但到目前為止，缺少比較敏感和準(zhǔn)確的診斷方法對(duì)萊姆病進(jìn)行早期診斷。因此，要做到及時(shí)預(yù)防和及時(shí)治療，在世界范圍內(nèi)還是個(gè)難題。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，萊姆病的致病病原體是一種叫做伯氏疏螺旋體（Borrelia Burgdorferi）的螺旋體，其外膜蛋白C（OspC）有非常強(qiáng)的抗原性和較強(qiáng)的免疫原性，機(jī)體在感染萊姆病的早期就可以產(chǎn)生特異性的IgM抗體，將這種抗體純化后，對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物模型在免疫后很短時(shí)間內(nèi)就可檢測(cè)到高濃度的IgM 抗體，目前，重組OspC 已用于萊姆病的臨床診斷中。

1 OspC的細(xì)胞定位與化學(xué)結(jié)構(gòu)

在進(jìn)行OspC 的抗原性研究之前，首先對(duì)其細(xì)胞定位與化學(xué)結(jié)構(gòu)做一定的研究，才有可能全面的研究其抗原性機(jī)制。

那么，外膜脂蛋白C（OspC）是萊姆病螺旋體的主要外膜蛋白之一，作為一種外膜蛋白，OspC 廣泛存在于螺旋體細(xì)胞外膜中。從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，β-桶狀結(jié)構(gòu)是其共有的結(jié)構(gòu)特征，不同的β-桶狀結(jié)構(gòu)由不同的偶數(shù)個(gè)β-折疊片組成，β-折疊的數(shù)量從8 ~ 22 個(gè)不等。在美國(guó)中西部、東北部等地區(qū)，發(fā)現(xiàn)25 種OspC 基因型的表達(dá)[1-2]。Elisabeth Baum 在其研究中指出，OspC 的179 氨基酸殘基至188 個(gè)殘基中的第五個(gè)C 末端折疊結(jié)構(gòu)是OspC的特異性交互抗體結(jié)合的關(guān)鍵位置[3]。OspC 作為一個(gè)表面暴露的脂蛋白，可以引起早起的免疫反應(yīng)[4-7]。在Elisabeth Baum 的研究中，得到了OspC的最大交互反應(yīng)區(qū)域的3D 圖形。如圖1，在圖中，OspC 二聚體的兩條鏈分別被標(biāo)以亮灰色與暗灰色。同時(shí)，在Elisabeth Baum 的研究中將OspC 二聚體中與抗體藥物關(guān)聯(lián)度最高的區(qū)域指出。其中，綠色部分代表與種OspC 有高關(guān)聯(lián)度，黃色部分表示與兩種OspC 蛋白有高關(guān)聯(lián)度，紅色部分表示與五種OspC 蛋白有高關(guān)聯(lián)[8]。

圖1 OspC 的最大交互反應(yīng)區(qū)域的3D 圖形

2 OspC的表達(dá)調(diào)控

伯氏疏螺旋體特異性地調(diào)節(jié)其外膜脂蛋白OspC 的合成，以感染宿主細(xì)胞。為了適應(yīng)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的免疫環(huán)境，螺旋體首先利用OspC 在哺乳動(dòng)物體內(nèi)建立起其感染過(guò)程。伯氏疏螺旋體大量產(chǎn)生OspA 和OspB，而OspC 在硬蜱體內(nèi)低表達(dá)，從蜱媒介傳播到哺乳動(dòng)物吸血后則出現(xiàn)上調(diào)[9]，以幫助伯氏疏螺旋體轉(zhuǎn)移到唾液腺[10]，進(jìn)而感染哺乳類(lèi)動(dòng)物[11-12]。感染一旦建立起來(lái)，OspC 的表達(dá)就會(huì)被抑制，以避免被宿主的免疫系統(tǒng)清除。同時(shí)伯氏疏螺旋體在人體內(nèi)初期呈現(xiàn)一個(gè)高表達(dá)狀態(tài)[13]，當(dāng)抗體產(chǎn)生后殺死了OspC 一直出現(xiàn)一個(gè)低表達(dá)克隆[14]。在表達(dá)基因的啟動(dòng)子中，反向重復(fù)序列的上游部分在調(diào)節(jié)OspC 的表達(dá)中起到關(guān)鍵作用。Dan Drecktrah 等[15]通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)在分子水平上切割了OspC 表達(dá)基因操作子的末端反向重復(fù)序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，打亂末端反向重復(fù)序列但保留鄰近的反向重復(fù)序列能夠阻止OspC 的合成。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，溫度，pH 以及DNA 超螺旋對(duì)于OspC 的合成也起到重要影響。Schwan 等[16]發(fā)現(xiàn)，在溫度為32 ~ 37℃的條件下， OspC 的表達(dá)量大幅度地提高。由此說(shuō)明，適宜的溫度是OspC 大量表達(dá)的重要條件， 在不適宜的溫度下，OspC 不表達(dá)或表達(dá)量很低。因此，近年來(lái)很多國(guó)外學(xué)者認(rèn)為，pH 值、溫度以及其他因素或許會(huì)對(duì)OspC 的免疫效果起到關(guān)鍵的影響[17-20]。更重要的是，比起核苷酸的序列，末端反向重復(fù)序列的堿基互補(bǔ)配對(duì)的存在對(duì)于控制OspC 的表達(dá)更為重要。Dan Drecktrah 的結(jié)果顯示，順式作用元件在OspC 毒力因子的表達(dá)上有關(guān)鍵的作用。

3 OspC致病性的研究

在對(duì)伯氏疏螺旋體外表面膜蛋白（OspC）致病性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，用OspC 與Salp15 結(jié)合，一起感染哺乳類(lèi)動(dòng)物，可以幫助伯氏疏螺旋體在局部定居，并抵抗免疫殺傷。2OspC 作為一個(gè)有效的免疫靶，表達(dá)下調(diào)時(shí)幫助伯氏疏螺旋體免疫逃逸，對(duì)OspC 在早期的感染中起重要作用[13]。雖然OspC是伯氏疏螺旋體關(guān)鍵的毒力因子之一，但是它在伯氏疏螺旋體的感染中的具體作用目前還不清楚。為了確定在接種了各種不同類(lèi)型的OspC 菌株后，OspC 是否會(huì)引起宿主反應(yīng)， Antonara 等分別接種了野生型OspC 菌株，突變型菌株以及完全突變型菌株后，對(duì)巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)行了測(cè)定。在21 種細(xì)胞因子的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞趨化蛋白（MCP-1），角質(zhì)細(xì)胞起源趨化因子（KC， CXCL1）以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在伯氏疏螺旋體的接種位點(diǎn)有表達(dá)量上升的趨勢(shì)。并且在接種一周內(nèi)的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)OspC 的表達(dá)量有不同的變化[21]。

4 OspC的診斷價(jià)值

到目前為止，缺少比較敏感和準(zhǔn)確的診斷方法對(duì)萊姆病進(jìn)行早期的診斷。因此，要做到及時(shí)診斷和治療，在世界范圍內(nèi)還是個(gè)難題。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，萊姆病的致病病原體伯氏疏螺旋體外膜蛋白C（OspC）有較強(qiáng)的免疫原性，機(jī)體在感染萊姆病的早期就可以產(chǎn)生特異性的OspC IgM 抗體，將OspC 純化后，對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物模型在免疫后很短時(shí)間內(nèi)就可以檢測(cè)到高濃度的IgM 抗體。目前，重組OspC 已用于萊姆病的臨床診斷。

近年的研究表明，OspC 作為伯氏疏螺旋體的主要外膜蛋白之一，具有很強(qiáng)的抗原性。Gilmore等[17]利用OspC 免疫12 只初生小鼠， 然后利用伯氏疏螺旋體菌株感染這12 只獲得免疫的初生小鼠， 由此發(fā)現(xiàn)了OspC 能夠使動(dòng)物產(chǎn)生高濃度的抗體， 使其具有抵抗伯氏疏螺旋體感染的能力。

目前有不少研究報(bào)道指出，OspC 在宿主體內(nèi)可以引起早期免疫反應(yīng)，因此有研究者致力于利用OspC 作為抗原用來(lái)診斷早期的萊姆病[22-24]。早年，Hauser 等[25]培養(yǎng)了大量不同萊姆病的菌株，并從中提取了大量的OspC 作為抗原，利用ELASA技術(shù)檢測(cè)了222 例萊姆病患者的血清和133 例對(duì)照供血者的血清。其結(jié)果顯示，有幾株菌株間的IgG 的檢測(cè)靈敏度非常相似。利用Western blot 技術(shù)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，OspC 確實(shí)可以作為一種靈敏的萊姆病早期診斷抗原。在此之后，Rousselle 等[6]通過(guò)對(duì)比772 株狹義氏疏螺旋體的OspC 與14kD 鞭毛蛋白片段等其他細(xì)胞抗原平行應(yīng)用于檢測(cè)萊姆病病人和無(wú)癥狀的對(duì)照組的IgG 與IgM， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgM 抗體的差異性最大。另外， Hauser 等[26]又做了進(jìn)一步的研究，利用WB 技術(shù)檢測(cè)了菌株P(guān)Ko、PBi 與Pka2 的 靈 敏 度， 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn)OspC 對(duì)早期萊姆病感染的檢出靈敏度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他抗原，并最終推薦了OspC 作為PKo 診斷的最敏感的抗原。

Jobe 等[27]的研究中發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)萊姆病的早期階段中，ELISA 可以作為一種有效的方式來(lái)檢測(cè)OspC 抗體，同時(shí)也能為成功治療萊姆病作為一個(gè)重要的判斷依據(jù)。

目前看來(lái)，OspC 作為伯氏疏螺旋體的主要抗原之一， OspC 雖然具有比較大的差異， 但其具有很強(qiáng)的特異性。因此，在診斷學(xué)臨床應(yīng)用中，將OspC作為診斷抗原，具有很大的臨床優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，如果將OspC 與其他的抗原相結(jié)合，進(jìn)行配伍診斷，那么這種診斷方法不僅能夠提高診斷的靈敏度， 還能減少與其他病原體的交叉反應(yīng)。這將在將來(lái)萊姆病的診斷中顯示出很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)與潛力。預(yù)計(jì)在今后的萊姆病防治中也會(huì)發(fā)揮一定的作用。至于在伯氏疏螺旋體的致病性上的研究， 目前的研究主要涉及于T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)、病原體本身的作用以及不同基因型螺旋體的作用。預(yù)計(jì)在以后的研究中，將會(huì)把OspC 與其他蛋白的研究相結(jié)合，從而獲取更多的研究結(jié)果，在萊姆病的各方面獲取進(jìn)一步的進(jìn)展。

付鈺廣等[28]利用來(lái)自SZ 菌株的重組蛋白OspC，進(jìn)行WB 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，重組的OspC 與陽(yáng)性血清有較強(qiáng)的反應(yīng)，同時(shí)SZ 菌株作為我國(guó)的流行菌株，若利用SZ 菌株的OspC 建立相對(duì)應(yīng)的ELISA方法來(lái)檢測(cè)伯氏疏螺旋體，這對(duì)我國(guó)萊姆病的預(yù)防和控制有很大作用，并有助于消除世界范圍內(nèi)萊姆病病患。同時(shí)，其研究的重組蛋白OspC（SZ 菌株）為建立羊體內(nèi)的伯氏疏螺旋體抗體的ELISA 檢測(cè)方法奠定了重要的基礎(chǔ)。

目前在世界范圍內(nèi)對(duì)于OspC 的研究已經(jīng)有了初步結(jié)果，對(duì)OspC 的研究有助于對(duì)萊姆病的發(fā)病原因，發(fā)病機(jī)理和發(fā)病規(guī)律進(jìn)行了解。并且已經(jīng)初步建立了利用OspC 作為檢測(cè)抗原用來(lái)檢測(cè)早期的萊姆病。但對(duì)于OspC 的深入研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還有待更深一步的實(shí)驗(yàn)與臨床研究。

[1] Kramer VL，Beesley C.Temporal and spatial distribution of Ixodes pacificus and Dermacentor occidentalis（Acari：Ixodidae） and prevalence of Borrelia burgdorferi in Contra Costa County，California[J].J Med Entomol，1993，30（3）：549-554.

[2] Barbour AG，Travinsky B.Evolution and distribution of the ospC Gene，a transferable serotype of Borrelia burgdorferi[J].MBio，2010，1（4）：：e00153-10.

[3] Elisabeth Baum1，Arlo Z，Randall M，et al.Barbo.Inferring Epitopes of a Polymorphic Antigen Amidst Broadly Cross-Reactive Antibodies Using Protein Microarrays：A Study of OspC Proteins of Borrelia burgdorferi[J].PLoS ONE，2013，8（6）：1-11.

[4] Kraiczy P，Hunfeld KP，Peters S，et al.Borreliacidal activity of early Lyme disease sera against complementresistant Borrelia afzelii FEM1 wild-type and an OspClacking FEM1 variant[J].J Med Microbiol，2000，49（10）：917-928.

[5] Montgomery RR，Malawista SE，F(xiàn)een KJ，et al.Direct demonstration of antigenic substitution of Borrelia burgdorferi ex vivo： exploration of the paradox of the early immune response to outer surface proteins A and C in Lyme disease[J].J Exp Med，1996，183（1）：261-269.

[6] Rousselle JC，Callister SM，Schell RF，et al.Borreliacidal antibody production against outer surface protein C of Borrelia burgdorferi[J].J Infect Dis，1998，178（3）：733-741.

[7] Jobe DA，Lovrich SD，Schell RF，et al.C-terminal region of outer surface protein C binds borreliacidal antibodies in sera from patients with Lyme disease[J].Clin Diagn Lab Immunol， 2003，10（4）：573-578.

[8] Baum E，Randall AZ，Zeller M.，et al.Inferring epitopes of a polymorphic antigen amidst broadly cross-reactive antibodies using protein microarrays： a study of OspC proteins of Borrelia burgdorferi[J].PLoS One，2013，8（6）：e67445.

[9] Eicken C，Sharma V，Klabunde T，et al.Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein C from Borrelia burgdorferi[J].J Biol Chem，2001，276（13）：10010-10015.

[10] Pal U，Yang XF，Chen M，et al.OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands[J].J Clin Invest，2004，113（2）：220-230.

[11] Ramamoorthi N，Narasimhan S，Pal U，et al.The Lyme disease agent exploits a tick protein to infect the mammalian host[J].Nature，2005，436（7050）：573-577.

[12] Grimm D，Tilly K，Byram R，et al.Outer-surface protein C of the Lyme disease spirochete： a protein induced in ticks for infection of mammals[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（9）：3142-3147.

[13] Seemanapalli SV，Xu Q，McShan K，et al.Outer Surface Protein C Is a Dissemination-Facilitating Factor of Borrelia burgdorferi during Mammalian Infection[J].PLoS ONE，2010，5（12）：e15830.

[14] Xu Q，Seemanapalli SV，McShan K，et al.Constitutive expression of outer surface protein C diminishes the ability of Borrelia burgdorferi to evade specific humoral immunity[J].Infect Immun，2006，74（9）： 5177-5184.

[15] Drecktrah D，Hall LS，Hoon-Hanks LL，et al.An inverted repeat in the ospC operator is required for induction in Borrelia burgdorferi[J].PLoS One，2013，8（7）：e68799.

[16] Schwan TG，Piesman J，Golde WT，et al.Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（7）：2909-2913.

[17] Gilmore RD Jr，Mbow ML.Conformational nature of the Borrelia burgdorferi B31 outer surface protein C protective epitope[J].Infect Immun，1999，67（10）：5463-5469.

[18] Wang G，van Dam AP，Dankert J.Evidence for frequent OspC gene transfer between Borrelia valaisiana sp.nov.and other Lyme disease spirochetes[J].FEMS Microbiol Lett，1999，177（2）：289-296.

[19] Zhong W，Gern L，Stehle T，et al.Resolution of experimental and tick-borne Borrelia burgdorferi infection in mice by passive，but not active immunization using recombinant OspC[J].Eur J Immunol，1999，29（3）：946-957.

[20] Wang IN，Dykhuizen DE，Qiu W，et al.Genetic diversity of ospC in a local population of Borrelia burgdorferi sensu stricto[J].Genetics，1999，151（1）：15-30.

[21] Antonara S，Ristow L，McCarthy J，et al.Effect of Borrelia burgdorferi OspC at the site of inoculation in mouse skin[J].Infect Immun，2010，78（11）：4723-4733.

[22] Wilske B，Habermann C，F(xiàn)ingerle V，et al.An improved recombinant IgG immunoblot for serodiagnosis of Lyme borreliosis[J].Med Microbiol Immunol，1999，188（3）：139-144.

[23] Mathiesen MJ，Christiansen M，Hansen K，et al.Peptidebased OspC enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of Lyme borreliosis[J].J Clin Microbiol，1998，36（12）：3474-3479.

[24] Magnarelli LA，F(xiàn)lavell RA，Padula SJ，et al.Serologic diagnosis of canine and equine borreliosis：use of recombinant antigens in enzyme-linked immunosorbent assays[J].J Clin Microbiol，1997，35（1）：169-173.

[25] Hauser U，Lehnert G，Wilske B.Validity of interpretation criteria for standardized Western blots （immunoblots） for serodiagnosis of Lyme borreliosis based on sera collected throughout Europe[J].J Clin Microbiol，1999，37（7）：22411.

[26] Hauser U，Lehnert G，Wilsk E.B1Diagnost ic value of proteins of three Borrelia species（Borrelia burgdorferi sensu lato）and implications for development an d use of recombinant antigens for serodiagnosis of Lyme borreliosis in Europe[J].Clin Diagn Lab Immunol，1998，5（4）：456-462.

[27] Jobe DA，Kowalski TJ，Bloemke M，et al.Rapid decline of OspC borreliacidal antibodies following treatment of patients with early Lyme disease[J].Clin Vaccine Immunol，2011，18（6）：1034-1037.

[28] 付鈺廣，關(guān)貴全，牛慶麗，等.伯氏疏螺旋體外膜蛋白C 的表達(dá)及抗原性分析[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（7）：661-665.