張海峰 馬愛玲 王漪檬 修 佳 趙紅衛(wèi) 秦玉花 趙寧民

河南省人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南鄭州 450003

依托咪酯是目前最常用的靜脈全麻藥，由于該藥具有代謝快、蓄積少、蘇醒快等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于麻醉誘導(dǎo)與維持[1]。本研究擬建立人血漿中依托咪酯的檢測(cè)方法學(xué)并驗(yàn)證方法學(xué)的可靠性。

1 資料與方法

1.1 儀器

Waters 1525 高效液相色譜儀，Waters 2489 紫外檢測(cè)器，AUW120D 電子天平（日本島津），WH-866 旋渦混合器，TL-420D 型電控多用恒溫水箱，上海800 型離心沉淀器。

1.2 試藥

依托咪酯對(duì)照品（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20121001，含量：99.9%）；甲醇為色譜純；二氯甲烷為分析純；水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（75 ∶25），流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：241nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取依托咪酯對(duì)照品5.0mg，置100mL 量瓶，用甲醇溶解并定容，制備成濃度為50μg/mL 的依托咪酯對(duì)照品貯備液。依次量取50μg/mL 的依托咪酯對(duì)照品貯備液適量，用甲醇稀釋成2.5、5、10、20、40、50μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.3 血漿樣品的處理

取空白血漿500μL 于10mL 具塞試管中，準(zhǔn)確加入500μL 依托咪酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合后，加入5mL二氯甲烷，漩渦混勻1min，3000r/min 離心5 min，取下層液4mL 于5mL 尖底試管中，在40℃水浴中用輕柔空氣吹干，用200μL 甲醇溶解，3000r/min 離心5min，取20μL 上清進(jìn)樣分析。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取空白血漿500μL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣檢測(cè)作為空白溶液色譜圖；平行取空白血漿500μL，加入依托咪酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣檢測(cè)作為空白血漿加對(duì)照品色譜圖；取手術(shù)病人依托咪酯0.6mg/kg 靜脈點(diǎn)滴給藥10min后動(dòng)脈血，置于EDTA 抗凝管中，血漿樣品按“2.3”項(xiàng)下方法處理并檢測(cè)作為患者血漿樣品色譜圖，記錄色譜圖見圖1。依托咪酯保留時(shí)間約5.5min，色譜峰峰形良好，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測(cè)定，本方法具有較高的專屬性。

圖1 人血漿中依托咪酯HPLC 色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

取空白血漿500μL 于10mL 具塞試管中，分別加 入50μL 濃 度 為2.5、5、10、20、40、50μg/mL 的 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配置成濃度為0.25μg/mL、0.5、1.01、2.0、4.0、5.0μg/mL 的依托咪酯血漿對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，取20μL 進(jìn)樣分析。以依托咪酯的血漿濃度作為橫坐標(biāo)，依托咪酯的峰面積作為縱坐標(biāo)，峰面積y 對(duì)濃度x 作線性回歸，線性方程為y=39285x-5124.6，r=0.9987，線性范圍為0.25 ～5.0μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取空白血漿500μL，分別加入依托咪酯標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配置成濃度為0.5、1.0、4.0μg/mL 的血漿對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，取20μL 進(jìn)樣分析。每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣5 次，計(jì)算RSD 作為日內(nèi)精密度；5 天內(nèi)每天測(cè)定1 次，計(jì)算RSD 作為日間精密度，結(jié)果見表1。

2.7 回收率試驗(yàn)

取空白血漿500μL，分別加入依托咪酯標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配置成濃度為0.5、1.0、4.0 μg/mL 的血漿對(duì)照品，每個(gè)濃度平行制備3 份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，取20μL 進(jìn)樣分析。用回歸方程計(jì)算檢出量，并與加入量比較，計(jì)算方法回收率，結(jié)果見表2。

表1 人血漿中依托咪酯精密度結(jié)果（n=5）

將空白血漿500μL 換成流動(dòng)相，同法配制上述3 種濃度的依托咪酯溶液，每個(gè)濃度平行制備3份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，取20μL 進(jìn)樣分析。將同濃度血漿樣品和流動(dòng)相制備的樣品峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表2。

表2 人血漿中依托咪酯回收率結(jié)果（n=3）

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取空白血漿500μL，分別加入依托咪酯標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配置成濃度為0.5、1.0、4.0μg/mL 的血漿對(duì)照品，每個(gè)濃度平行制備3 份，放置于-30℃低溫冰箱保存，分別于第7 天、15 天、30 天取出血漿對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，取20μL 進(jìn)樣分析。結(jié)果各濃度的RSD 均小于4.1%，表明血漿中依托咪酯-30℃低溫冰箱保存30d 穩(wěn)定性好。

3 討論

依托咪酯制劑中依托咪酯的含量測(cè)定方法，國(guó)內(nèi)已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道[2-6]，但存在檢測(cè)速度慢、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。血漿中藥物濃度的檢測(cè)方法和制劑中藥物濃度的檢測(cè)方法有較大不同，本研究擬建立人血漿中依托咪酯的檢測(cè)方法學(xué)。

文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)：血漿中依托咪酯的含量測(cè)定方法國(guó)外已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道[7-11]，國(guó)內(nèi)僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道[12]。本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜法采用甲醇-水（75 ∶25）為流動(dòng)相，流動(dòng)相配置簡(jiǎn)單，樣品出峰快，出峰時(shí)間大約在5.5min，該方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、可靠，更適用于人血漿中依托咪酯濃度的測(cè)定。

本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)采用了沉淀蛋白法進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理，分別采用400μL 甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑沉淀蛋白后，取上清進(jìn)樣。但是檢測(cè)靈敏度達(dá)不到臨床要求。在上述方法的基礎(chǔ)上，沉淀蛋白后取上清500μL，空氣吹干，用100μL 甲醇復(fù)溶濃縮后進(jìn)樣，但是靈敏度還是不夠，因此沉淀蛋白法不適用本研究。正式試驗(yàn)改用了液液萃取法，取得了良好的效果。由于依托咪酯極易溶于三氯甲烷，所以本試驗(yàn)選擇了毒性較小的二氯甲烷作為萃取溶劑，結(jié)果表明，提取回收率與靈敏度均符合要求。

本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)[3]上優(yōu)化了色譜條件是，采用甲醇-水為流動(dòng)相，優(yōu)化其比例為75：25，室溫條件下，檢測(cè)波長(zhǎng)為241nm，流速為1.0mL/min，依托咪酯在5.5min 出峰。血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測(cè)定，具有較好的專屬性。改進(jìn)后建立的HPLC 法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，專屬性及重現(xiàn)性良好，可用于藥代動(dòng)力學(xué)研究。

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