崔喜艷，陳眾峰，范 貝，韓 琳，劉曉慶，董雅致，張治安

(吉林農(nóng)業(yè)大學 a 生命科學學院，b 農(nóng)學院，吉林 長春130118)

大豆rbcS基因啟動子的克隆及在轉基因煙草中的功能缺失分析

崔喜艷a，陳眾峰a，范 貝a，韓 琳a，劉曉慶a，董雅致b，張治安b

(吉林農(nóng)業(yè)大學 a 生命科學學院，b 農(nóng)學院，吉林 長春130118)

【目的】 進一步驗證栽培大豆rbcS基因啟動子功能，為植物基因工程相關研究提供啟動子資源?！痉椒ā?從栽培大豆中克隆了rbcS基因5′端上游1 538 bp的DNA序列，根據(jù)光誘導表達調(diào)控元件及順式作用功能元件所在的位置，設計含1 089，712和190 bp 3個5′ 端缺失體，并將rbcS基因啟動子(1 538 bp)及3個5′ 端系列缺失體序列分別與gus基因融合，構建植物表達載體并命名為pGmrbcS、pA、pB和pC，用農(nóng)桿菌介導法轉化煙草，通過gus基因活性變化檢測不同缺失體的表達特性?！窘Y果】 克隆了1 538 bp的大豆rbcS基因啟動子序列及1 089，712和190 bp 的5′ 端缺失體啟動子片段。GUS 活性檢測表明，在pGmrbcS轉基因煙草的葉中GUS活性最高，且與pCAMBIA1301轉基因煙草葉片中CaMV35S啟動子驅使gus基因的表達量相當，而莖、根中GUS活性較低。GUS定量分析表明，T1代轉基因煙草光下培養(yǎng)時，3種缺失體啟動子葉片中的GUS表達活性均與CaMV35S 啟動子相當，其中pB活性最高，是CaMV35S啟動子活性的1.4 倍,pA、pC活性低于pB，分別為pB活性的84%和71%；含pA 的轉基因煙草于黑暗中萌發(fā)的幼苗葉片gus基因不表達，光下萌發(fā)幼苗葉片有gus基因表達，而含有 pB、pC的轉基因煙草，在黑暗和光下萌發(fā)的幼苗葉片中均有gus基因表達，且表達量以pB最高?！窘Y論】 含有長度為1 089 bp(pA)光誘導元件的rbcS基因缺失體啟動子具有光誘導和組織特異表達特性，長度為712 bp (pB)的缺失體啟動子的啟動活性最高。

大豆；rbcS基因啟動子；轉基因煙草；功能缺失

植物基因工程研究中常用的啟動子，按作用方式及功能主要分為組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異性啟動子3類[1]，但這種分類并不是絕對的，有一些啟動子往往兼有其他類型啟動子的特性，如高等植物光合作用的關鍵酶——1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco,EC.4.1.1.39)的小亞基(rbcS)基因啟動子，就兼有光誘導性和葉組織特異性[2]。Rubisco主要存在于葉綠體的間質(zhì)中，占葉片可溶性蛋白的40%以上，由8個大亞基(rbcL)和8個小亞基(rbcS)組成。在Rubisco全酶中，rbcL主要起催化作用，rbcS具有調(diào)控Rubisco 活性的功能[3]。目前，已對多種植物的rbcS基因啟動子進行了廣泛的研究[4-6]。Marraccini等[7]證實，克隆的咖啡rbcS基因啟動子能使轉基因煙草中gus基因的表達具有光誘導活性和葉組織特異性。Kyozuka等[8]將水稻、煙草的rbcS基因啟動子與gus基因融合并將其重新轉入水稻后發(fā)現(xiàn)，gus基因的表達亦有光誘導活性和組織特異性。Gittins等[9]在研究大豆rbcS基因SRS1啟動子時發(fā)現(xiàn)，SRS1啟動子能驅動uidA基因在轉基因蘋果的光合組織中表達，同時uidA基因的表達也具有光誘導活性。綜上可知，rbcS基因的啟動子除具有光誘導活性外，同時亦能驅使外源基因在轉基因植物的特定部位表達。

2011年,劉曉慶[10]克隆了大豆rbcS基因啟動子，但未對該啟動子功能進行系統(tǒng)研究。啟動子缺失分析是研究啟動子及調(diào)控元件功能的一種重要且有效的方法[11-12]，該方法先是獲取一系列啟動子5′端缺失體片段，然后將這些片段分別與報告基因融合構建植物表達載體，在轉化的模式植物中檢測報告基因活性，從而確定啟動子的功能及一些調(diào)控元件的作用[13-14]。為了進一步明確栽培大豆rbcS基因啟動子在轉基因煙草中的功能，本研究依據(jù)克隆的栽培大豆rbcS基因啟動子的DNA序列，用軟件分析各調(diào)控元件所在的位置，克隆了一系列不同長度啟動子5′端缺失體片段，同時將這些片段分別與gus基因融合，構建植物表達載體，用農(nóng)桿菌介導法轉化煙草，通過gus基因活性變化檢測不同缺失體的表達特性，從而驗證栽培大豆rbcS基因啟動子的功能，并分離具有最大轉錄活性的最小啟動子，旨在為植物基因工程的相關研究提供啟動子資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

大豆“吉農(nóng)13”種子由吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院生物化學與分子生物學研究室保存。取飽滿的大豆種子5粒，盆栽土培于營養(yǎng)缽中，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，白天(26±0.5) ℃，夜晚(15±0.5) ℃，照光12 h，每天08:00-08:30澆水50 mL，取生長2周的大豆葉片，用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

煙草NC89、植物表達載體pCAMBIA1301、根癌農(nóng)桿菌LBA4404和含有prk2013質(zhì)粒的大腸桿菌，均由吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術研究所惠贈。

DNA提取試劑盒、核酸限制性內(nèi)切酶PstⅠ和NcoⅠ、Ex-Taq酶、T4DNA 連接酶、pMD18T載體和DNA分子量標準，均為TaKaRa公司產(chǎn)品；羥甲香豆素(4-methylumbelliferone，4-MU)、4-甲基傘形酮-β-D-葡糖醛酸苷(4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide，MUG)，均購自北京樂博生物科技有限公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 不同長度5′端啟動子克隆及植物表達載體的構建

應用Primer 5.0軟件，參照文獻[10]設計rbcS基因啟動子的克隆引物。引物由上海生工技術有限公司合成，純度為PAGE級。

GmSS：5′-AACTGCAG TGTGTAGTATCA-TAGAGT-3′；

GmSP1：5′-AACTGCAG CATGCCTCACT-GCTAGAA-3′；

GmSP2：5′-AACTGCAG ACCAAGCTTGA-TAAGCCC-3′；

GmSP：5′-CATGCCATGGGCTTCTCCTT-CTTAGTTC-3′；

GmSP3S：5′-AACTGCAG GCCTCCTCCA-CGTGTCACTTC-3′；

GmSP3A：5′-CATGCCATGG TATATATA-ATAGTGTGATTTG -3′；

其中GmSS、GmSP1、GmSP2及GmSP3S帶PstⅠ酶切位點CTGCAG， GmSP 和GmSP3A帶NcoⅠ酶切位點CCATGG。

以大豆葉片中提取的DNA為模板，用引物GmSS/GmSP進行PCR擴增。擴增程序為：94 ℃預變性2 min ；94 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫15 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，回收目的條帶(1 538 bp,命名為GmrbcS)，與pMD18T載體連接后，轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，挑取菌落，驗證為陽性菌的送至上海生工技術有限公司測序。

用引物GmSP1/GmSP、GmSP2/GmSP和GmSP3S/GmSP3A進行PCR擴增。擴增程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度分別為43，46和45 ℃)，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫15 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，回收目的條帶，分別獲得1 089 bp 的片段A，712 bp 的片段B和190 bp 的片段 C。將A、B、C分別與pMD18T載體連接后，轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，挑取菌落，驗證為陽性菌的送至上海生工技術有限公司測序。

用PstⅠ/NcoⅠ酶切上述 4 種不同長度的 DNA 片段，DNA凝膠回收試劑盒回收后備用(按說明書操作)。同樣用PstⅠ/NcoⅠ處理植物表達載體pCAMBIA1301，與回收的 4 種不同長度的片段連接：取5 μL目的基因片段和1.5 μL pCAMBIA1301、1 μL 10×T4Ligase Buffer、0.5 μL T4Ligase，補水至10 μL，16 ℃過夜連接，構建含不同長度啟動子的植物表達載體，命名為pGmrbcS、 pA、pB和pC。

1.3 煙草遺傳轉化

采用三親雜交法將構建好的植物表達載體pGmrbcS、 pA、pB和 pC轉入農(nóng)桿菌 LBA4404。將含有植物表達載體的農(nóng)桿菌LBA4404接種到 YEB 液體培養(yǎng)基 (含50 mg/L Kan+50 mg/L Rif) 中， 過夜180 r/min 振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)物用 YEB液體培養(yǎng)基按 1∶1 的體積比進行稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)至菌液OD600值為 0.5，并利用此培養(yǎng)物侵染生長20～30 d、切成0.5 cm×0.5 cm的無菌煙草葉片。侵染后，將葉片擺放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)3 d。將經(jīng)過共培養(yǎng)的煙草外植體轉移到抗性芽篩選培養(yǎng)基(MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2.5 mg/L Hyg+500 mg/L Cef)上進行培養(yǎng)，獲得轉基因煙草植株。收獲種子后，繼續(xù)培養(yǎng)至T1代。

1.4 轉基因植株GUS 組織化學染色

隨機選取苗齡5～9 d的T1代3種缺失體(pA、pB和pC)的轉基因煙草葉片，切成0.6 cm×0.6 cm大小，浸入適量GUS染液中， 37 ℃避光染色4 h，沸水浴條件下用體積分數(shù)75%酒精對葉片進行脫色，除去葉綠素，數(shù)小時后觀察葉片GUS的著色情況。

1.5 轉基因煙草GUS活性的檢測

1.5.1 GUS粗酶液的提取 取不同轉基因煙草材料0.1 g于預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉，加入1 mL預冷的GUS提取液(100 mmol/L PBS緩沖液(pH 8.0)、10 g/L PVP、10 mmol/L β-巰基乙醇)，制成勻漿，冰浴1 h，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，收集上清液即為粗酶液。每個樣品重復3次。

1.5.2 4-MU標準曲線的制作及GUS酶活的定義 用0.2 μmol/L Na2CO3(反應終止液)將1 mmol/L 4-MU的母液稀釋成不同濃度，用970CRT熒光分光光度計在發(fā)射光為465 nm、激發(fā)光為365 nm、狹縫為25 nm時，對不同濃度4-MU的熒光強度進行測定，重復3次，計算平均值后繪制標準曲線。GUS粗酶液中的總蛋白含量測定參見文獻[15]的方法。

將每分鐘水解4-MUG生成1 pmol 4-MU的酶量定義為1個活力單位，GUS活性用每微克總蛋白的酶活力表示，單位為pmol/(μg·min)。

1.5.3 GUS粗酶液中GUS活性的測定 取10 μL GUS粗酶液和190 μL、37 ℃預熱的反應緩沖液(1 mmol/L MUG)，加入到1.5 mL的離心管中，輕微混勻，迅速取出50 μL加入到4.95 mL反應終止液中振蕩混勻，此為0 min反應樣品；將離心管放在37 ℃的水浴中進行酶反應，20 min后迅速取出50 μL加到4.95 mL反應終止液中振蕩，混勻后作為酶反應20 min的樣品。以0 min反應樣品為空白對照，在發(fā)射光為465 nm、激發(fā)光為365 nm、狹縫為25 nm的條件下，對酶反應20 min樣品的熒光強度進行檢測。重復3次取平均值，利用4-MU標準曲線計算4-MU的含量。

1.5.4 含不同長度GmrbcS基因啟動子的GUS活性檢測 將轉pA、pB和pC的T1代不同類型轉基因煙草種子分別在黑暗和光下進行萌發(fā)， 10 d后將在黑暗中萌發(fā)的幼苗轉移至光下復光培養(yǎng) 2 d[12]，分別隨機選取3株植株，抽提其葉片中的GUS蛋白；然后對黑暗和光下生長的幼苗葉片進行GUS 定量分析，從而確定啟動子的光誘導表達特性。

2 結果與分析

2.1 大豆rbcS基因啟動子及缺失體啟動子片段的克隆

用試劑盒提取大豆葉片基因組DNA，OD260/OD280值為1.827。以此DNA為模板，GmSS/GmSP、GmSP1/GmSP、GmSP2/GmSP和GmSP3S/GmSP3A為引物，進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，分別獲得1 538 bp(GmrbcS)、1 089 bp(A)、712 bp(B)和190 bp(C)單一擴增帶(圖1)。將片段GmrbcS、A、B和C切膠回收后與pMD18T載體相連，轉化后挑取陽性菌送至上海生工技術有限公司測序。測序結果的堿基比對表明，GmrbcS、A、B和C的同源性為100%。片段GmrbcS為 1 538 bp，是全長rbcS基因啟動子，與劉曉慶[10]克隆的大豆rbcS基因啟動子的同源性為100%，與GenBank中大豆rbcS基因啟動子SRS4 (M16889.1) 的同源性為98%。表明克隆的大豆rbcS基因及缺失體啟動子的DNA序列是正確的，可分別用于構建植物表達載體。

PlantCARE分析結果(圖2)表明，大豆rbcS基因啟動子序列共有10個GATA盒(GATA)、5個I盒(GATAAG)、1個GT-1結合位點(GGTTAA)和1個G盒(CACGTG)，為葉組織特異性的功能元件，這些元件是光誘導表達啟動子和組織特異性的保守元件[16-19]；同時還含有6個啟動子區(qū)和增強子區(qū)共同的順式作用元件(CAAT)和1個TATA盒，后二者為啟動子所必需。

2.2 大豆rbcS基因啟動子及缺失體啟動子片段植物表達載體的構建

根據(jù)光誘導調(diào)控元件及啟動子順式作用功能元件所在的位置，設計3種不同長度5′端缺失體啟動子[17-19]，引物序列具體部位如圖2所示，3個缺失體啟動子均有葉組織特異性G盒。利用PCR方法獲得rbcS基因啟動子的一系列5′缺失體1 089 bp 的片段A、712 bp 的片段B、190 bp 的片段 C。利用酶切-連接的方法，將全長rbcS基因啟動子及不同長度缺失體啟動子與pCAMBIA1301連接構建植物表達載體，命名為pGmrbcS、pA、pB和pC。其中pA含有8個GATA盒(GATA)、4個I盒(GATAAG)、6個順式作用元件(CAAT)、1個G盒和1個TATA盒；pB含有 6個GATA盒(GATA)、3個I盒(GATAAG)、5個順式作用元件(CAAT)、1個G盒和1個TATA盒；pC含有1個GATA盒(GATA)、1個I盒(GATAAG)、3個順式作用元件(CAAT)、1個G盒和1個TATA盒。缺失體表達框如圖3所示。由圖4可見，用PstⅠ/NcoⅠ對大豆rbcS基因啟動子及不同長度缺失體啟動子植物表達載體進行雙酶切后，分別獲得1 538，1 089，712和190 bp的片段，說明大豆rbcS基因及不同長度缺失體啟動子植物表達載體構建成功。

2.3 rbcS基因啟動子轉基因植株的GUS活性檢測

取分別轉pGmrbcS、pCAMBIA1301表達載體的轉基因煙草植株，對其葉、莖、根各組織進行GUS活性檢測，結果如圖5所示。由圖5可見，在pCAMBIA1301轉基因煙草的葉、莖、根中都檢測到GUS活性，說明CaMV35S啟動子能驅動外源基因在煙草中的表達；在pGmrbcS轉基因煙草的葉中檢測到較高的GUS活性且與CaMV35S啟動子驅使gus基因的表達量相當，在根、莖中只檢測到微弱的GUS活性，表明栽培大豆rbcS基因啟動子驅動外源基因在轉基因煙草的葉片中高表達，在根、莖中表達量很低。該結果與孫家利等[2]和韓琳[15]的研究結果一致。

2.4 含不同長度5′ 端缺失體啟動子轉基因煙草的獲得

通過農(nóng)桿菌侵染的方法轉化煙草葉片,分別獲得含有pA、pB和pC的轉基因煙草植株32、18和10株。GUS組織化學染色結果(圖6)證明，rbcS基因不同長度5′ 端缺失體啟動子驅動的gus基因在轉基因煙草葉片中均有表達。

2.5 不同長度5′ 端缺失體rbcS基因啟動子轉基因煙草葉片的GUS活性檢測

為了確定啟動子的表達活性，選取10 株不同長度5′ 端缺失體rbcS基因啟動子的轉基因煙草，且GUS 組織化學檢測為陽性的植株葉片進行GUS 定量分析，結果(圖7)表明，啟動子pA、pB和pC均表現(xiàn)出較高的活性，其中pB活性最高，是 CaMV35S 啟動子活性的1.4 倍。其他2個啟動子缺失體(pA，pC)活性較低，分別為pB活性的84%和71%，其中活性最小的pC與CaMV35S 啟動子的活性差別不大。

2.6 轉基因煙草中不同長度5′端缺失體rbcS基因啟動子的光誘導表達特性

為檢測不同長度缺失體rbcS基因啟動子的光誘導表達特性，將T1代不同轉基因煙草的種子分別在黑暗和光下進行萌發(fā),10 d 后將在黑暗中萌發(fā)的幼苗轉移至光下復光培養(yǎng)2 d，然后對黑暗和光下生長的幼苗葉片進行GUS 定量分析，以確定啟動子的光誘導表達特性。結果(圖8)顯示，含有光誘導元件的pA轉基因煙草葉片，在黑暗中萌發(fā)檢測不到GUS的表達， 而在光下萌發(fā)或在黑暗中萌發(fā)后復光培養(yǎng)的葉片中均能檢測到gus基因的表達；含有 pB、pC的轉基因煙草葉片，在黑暗和光下萌發(fā)的幼苗中都能檢測到gus基因的表達。以上結果說明， 只有pA啟動子具有光誘導特異表達的特性，其他缺失體(pB和pC)均為組成型表達，且不受光誘導的影響。

3 討 論

相關研究表明，大豆rbcS基因的轉錄具有明顯的晝夜節(jié)律變化，而且這種節(jié)律變化受光照的影響[20]。說明光對光合作用相關基因的調(diào)控對植物光合作用有重要影響。通過PlantCARE在線分析啟動子序列，發(fā)現(xiàn)本研究所克隆的rbcS基因啟動子中含有多個組織特異性及光誘導的核苷酸序列，包括GT-1結合位點(GGTTAA)、I盒(GATAAG)、G盒(CACGTG)、GATA模型，該啟動子序列中還含有多個順式作用元件(CAAT)和1個TATA盒，二者為啟動子所必需[16]。Green等[17]首次從豌豆rbcS-3A啟動子中分離出對光敏感的GT結合位點。在黑暗狀態(tài)下，GT結合位點負責關閉光調(diào)控基因的轉錄[18]。I盒(GATAAG)是光誘導基因上游的保守元件，Donald 等[19]采用缺失的方法分析擬南芥rbcS-1A基因啟動子時發(fā)現(xiàn)，I盒能調(diào)節(jié)rbcS-1A基因的光誘導表達。

本試驗成功克隆了1 538 bp的大豆rbcS基因啟動子序列并對其進行了分析，發(fā)現(xiàn)其上含有許多與光誘導有關的順式作用元件，共有10個GATA盒(GATA)、5個I盒(GATAAG)、1個GT-1結合位點(GGTTAA)和1個G盒(CACGTG)及6個啟動子區(qū)與增強子區(qū)共同的順式作用元件(CAAT)和 1個TATA盒。采用5′端缺失體構建了一系列不同長度的載體對rbcS基因啟動子功能進行驗證，其中pA中含有8個GATA盒(GATA)、4個I盒(GATAAG)、6個順式作用元件(CAAT)、1個G盒和1個TATA盒；pB中有 6個GATA盒(GATA)、3個I盒(GATAAG)、5個順式作用元件(CAAT)、1個G盒和1個TATA盒；pC中有1個GATA盒(GATA)、1個I盒(GATAAG)、3個順式作用元件(CAAT)、1個G盒和1個TATA盒。GT-1保守序列和順式作用元件都能調(diào)節(jié)基因受光誘導后的轉錄活性，隨著這些元件的缺失，增強子的數(shù)量隨之減少，基因的表達量都會改變[21]。

本研究結果表明，將不同長度的啟動子片段與gus基因相融合并對煙草進行轉化，發(fā)現(xiàn)在轉基因煙草葉片中gus基因均有表達，不同缺失體片段的GUS活性表達差異明顯。GUS 組織化學分析表明，在pGmrbcS轉基因煙草葉中檢測到較高的GUS活性，且與CaMV35S啟動子驅動gus基因的表達量相當，而在莖、根中只檢測到微弱的GUS活性；GUS定量分析表明，轉基因煙草的 T1代在光下培養(yǎng)時，啟動子pA、pB和pC驅動gus基因在煙草的葉片中均有表達,啟動子pB表現(xiàn)出最高的活性，是 CaMV35S 啟動子活性的1.4倍。通過對其進行的光誘導試驗可知，光誘導相關元件能提高rbcS基因啟動子驅動gus基因表達活性，隨著功能元件的減小，光誘導能力隨之降低。

本試驗結果還表明，含有多個光誘導元件的 1 089 bp(pA)rbcS基因啟動子具有光誘導和組織特異表達特性，而其他缺失體(712 bp(pB)和190 bp(pC))則僅具有組織特異性表達特性，說明了光誘導元件對光誘導型啟動子的重要性。本試驗克隆的rbcS基因啟動子pGmrbcS及3種不同長度的rbcS基因缺失體啟動子pA、pB和pC，在驅動外源gus基因表達活性上均與CaMV35S啟動子相當，該4種啟動子可用于植物基因工程的相關研究，也可為進一步深入探討rbcS基因啟動子調(diào)控Rubisco表達的分子機制提供理論參考。

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Cloning ofrbcSgene promoter fromGlycinemaxand dysfunctional analysis in transgenic tobacco

CUI Xi-yana,CHEN Zhong-fenga,FAN Beia,HAN Lina,LIU Xiao-qinga,DONG Ya-zhib,ZHANG Zhi-anb

(aSchoolofLifeSciences,bCollegeofAgronomy,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 This study aimed to verify the function ofrbcSgene promoter of soybean and provide resource for plant genetic engineering.【Method】 Sequence of a 5′-upstream DNA segment (1 538 bp) ofrbcSgene from soybean was cloned.Based on location of light-inducible regulatory element and cis-acting functional element, three 5′-end series deletions with lengths of 1 089,712 and 190 bp were constructed and fused withgusgene in addition torbcSpromoter to form expression vectors of pA,pB,pC and pGmrbcS,respectively.All vectors were transformed into tobacco with theAgrobacterium-mediated method and expression characters of different deletions were detected through the change ofgusgene activity.【Result】 Promoter sequence (1 538 bp) ofrbcSgene from soybean and three 5′-end deletion promoters with lengths of 1 089,712 and 190 bp were cloned.GUS activity detection shows that the highest GUS activity was detected in transgenic tobacco leaves with pGmrbcS,similar to that ofgusgene driven by CaMV35S promoter in transgenic tobacco leaves of pCAMBIA1301.Weak GUS activity was detected in stem and root.GUS quantitative analysis shows that the expression activities of three deletion promoters in leaves were similar to that of CaMV35S promoter when T1progeny seeds of transgenic tobacco were cultured with light.pB had the highest activity,which was 1.4 times of that of CaMV35S.The activities of pA and pC were 84% and 71% of that of pB.Expression ofguswas detected in the leaves of transgenic tobacco seedling with pA cultured with light while it was not in the dark.Expression ofguswas detected in the leaves of transgenic tobacco seedling with pB and pC cultured in both dark and light and the expression in pB was highest.【Conclusion】 TherbcSgene deletion promoter with length of 1 089 bp containing light-inducible element (pA) was light inducible and expressed tissue-specific character,and the deletion promoter with length of 712 bp (pB) had the highest activity.

Glycinemax;rbcSgene promoter;transgenic tobacco;function deletion

2014-07-24

國家自然科學基金項目(31171459)；吉林省自然科學基金項目(201215178)

崔喜艷(1971-)，女(達斡爾族)，吉林長春人，副教授，博士，主要從事植物基因工程研究。 E-mail:cuixiyan2005@163.com

張治安(1964-)，男，吉林長春人，教授，博士生導師，主要從事作物生理生態(tài)研究。E-mail:zhangzhian6412@163.com

時間:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.005

S565.103.4；Q943.2

A

1671-9387(2015)05-0114-08

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.005.html