王東勝，薛泉宏，高 卉，張俊會(huì)，馬 鑫，陳姣姣

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004)

CaCl2對(duì)低鈣土壤中可培養(yǎng)放線(xiàn)菌數(shù)量及種類(lèi)的影響

王東勝1，2，薛泉宏1，高 卉1，張俊會(huì)1，馬 鑫1，陳姣姣1

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004)

【目的】 分析CaCl2對(duì)碳酸鈣含量較低土壤中可培養(yǎng)放線(xiàn)菌數(shù)量及種類(lèi)的影響，探索建立新的放線(xiàn)菌分離方法?！痉椒ā?以海拔高度及碳酸鈣含量不同的秦嶺太白山北坡山地土壤為材料，通過(guò)稀釋平皿涂抹法分離放線(xiàn)菌，研究了高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入CaCl2后低鈣土壤中可培養(yǎng)放線(xiàn)菌數(shù)量及種類(lèi)的變化，并用菌落形態(tài)特征和16S rDNA序列鑒定新出現(xiàn)的放線(xiàn)菌。【結(jié)果】 向高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入CaCl2后，供試低鈣土壤樣品中可培養(yǎng)放線(xiàn)菌總數(shù)及鏈霉菌數(shù)量減少，同時(shí)所有供試土壤樣品中均有部分在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的放線(xiàn)菌種類(lèi)消失；供試土壤中有90種新出現(xiàn)的放線(xiàn)菌種類(lèi)，從中獲得了29株代表性菌株。根據(jù)菌落形態(tài)特征及16S rDNA序列鑒定可知，新出現(xiàn)的29株放線(xiàn)菌主要為鏈霉菌屬和小單孢菌屬，其中65.5%具有生物活性及其他應(yīng)用價(jià)值?！窘Y(jié)論】 向高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入CaCl2，可從低鈣土壤中分離到一些新的放線(xiàn)菌，其中有較多的活性物質(zhì)產(chǎn)生菌。

CaCl2；山地土壤；放線(xiàn)菌分離；高氏1號(hào)培養(yǎng)基

放線(xiàn)菌是一類(lèi)具有廣泛實(shí)際用途的生物資源，能產(chǎn)生多種具有各種生物活性的代謝產(chǎn)物。從自然界發(fā)現(xiàn)和篩選新的活性物質(zhì)產(chǎn)生菌是新藥研制的關(guān)鍵性基礎(chǔ)工作，但長(zhǎng)期的分離篩選使自然界中未知的新活性物質(zhì)產(chǎn)生菌愈來(lái)愈少，利用傳統(tǒng)方法獲得新的放線(xiàn)菌及新的活性物質(zhì)已經(jīng)變得越來(lái)越難。改變分離方法是獲得新放線(xiàn)菌及新活性物質(zhì)的有效途徑之一，其中改變培養(yǎng)基成分會(huì)獲得具有不同營(yíng)養(yǎng)及生理特性的新放線(xiàn)菌。鈣離子是生物體的必需元素，參與細(xì)胞的多種生理活動(dòng)，對(duì)維持細(xì)胞各種代謝過(guò)程極為重要，是各種生物體中最為普遍的第二信使之一[1]。在原核細(xì)胞中，鈣離子與許多生理生化反應(yīng)相關(guān)，包括細(xì)胞分化、致病性、趨化性、細(xì)胞膜的形成以及滲透阻力等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，加入碳酸鈣對(duì)土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理，可以增加酸性土壤中可培養(yǎng)放線(xiàn)菌的數(shù)量，或可以分離到特殊的放線(xiàn)菌[3-5]。Jensen[3]研究發(fā)現(xiàn)，在酸性土壤中加入碳酸鈣可以使土壤放線(xiàn)菌數(shù)量顯著增加。Otoguro等[4]利用碳酸鈣對(duì)39個(gè)土樣和植物樣進(jìn)行富集培養(yǎng)，結(jié)果分離到了動(dòng)孢放線(xiàn)菌屬放線(xiàn)菌。Uzel等[5]用10 g/L的碳酸鈣在100 ℃下對(duì)溫泉土壤處理1 h后，選擇性地分離到了許多高溫放線(xiàn)菌。另有研究發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基中加入CaCl2可以促進(jìn)Actinobisporayunnanensis氣生菌絲的生長(zhǎng)[6]，或增加碳酸鈣含量較高土壤中可培養(yǎng)放線(xiàn)菌數(shù)量及廣譜高效拮抗放線(xiàn)菌的種類(lèi)[7]。但目前尚不清楚向培養(yǎng)基中加入CaCl2對(duì)低鈣土壤中放線(xiàn)菌數(shù)量及種類(lèi)有何影響。為此，本試驗(yàn)以秦嶺太白山不同海拔高度碳酸鈣含量較低的山地土壤為材料，分析了高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入CaCl2對(duì)山地土壤可培養(yǎng)放線(xiàn)菌數(shù)量及種類(lèi)的影響，旨在探索利用改變培養(yǎng)基成分分離新放線(xiàn)菌資源及活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的可行性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤樣品 10種供試土壤采自秦嶺太白山北坡(33°57′～34°58′ N，107°45′～107°53′ E，海拔800～3 670 m)，土壤類(lèi)型分別屬于山地淋溶褐土、山地棕壤和亞高山草甸土。供試土壤基本性質(zhì)見(jiàn)表1。

1.1.2 培養(yǎng)基 主要培養(yǎng)基有高氏1號(hào)培養(yǎng)基[8]、高氏1號(hào)加鈣培養(yǎng)基[7](高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入5 g/L CaCl2)。

1.2 方 法

1.2.1 放線(xiàn)菌的分離及數(shù)量測(cè)定 采用稀釋平皿涂抹法[8]。分別稱(chēng)取10.0 g供試土壤加入裝有90.0 mL無(wú)菌水的三角瓶中，120 r/min振蕩30 min進(jìn)行10-1稀釋?zhuān)来挝?.0 mL加入9.0 mL無(wú)菌水中做10-2～10-5稀釋。分別吸取0.05 mL 10-3，10-4和10-53個(gè)稀釋度的樣品懸液涂布于高氏1號(hào)培養(yǎng)基及高氏1號(hào)加鈣培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)15 d后進(jìn)行測(cè)定。

統(tǒng)計(jì)各供試土樣中的放線(xiàn)菌總數(shù)、鏈霉菌數(shù)量、放線(xiàn)菌種類(lèi)數(shù)(將培養(yǎng)皿中菌落形態(tài)有明顯差異的菌落視為不同種類(lèi))，以及高氏1號(hào)加鈣培養(yǎng)基中新出現(xiàn)與消失的放線(xiàn)菌種類(lèi)數(shù)。其中可培養(yǎng)放線(xiàn)菌總數(shù)根據(jù)培養(yǎng)皿中所有放線(xiàn)菌的菌落數(shù)計(jì)算；鏈霉菌數(shù)量按培養(yǎng)皿中菌落形態(tài)可以確定為鏈霉菌的菌落數(shù)計(jì)算；新出現(xiàn)放線(xiàn)菌是指不能在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而只在高氏1號(hào)加鈣培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的放線(xiàn)菌；消失放線(xiàn)菌是指只在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而在高氏1號(hào)加鈣培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的放線(xiàn)菌。

1.2.2 新出現(xiàn)放線(xiàn)菌的分類(lèi)鑒定 對(duì)供試土樣在高氏1號(hào)加鈣培養(yǎng)基上分離到的新出現(xiàn)的放線(xiàn)菌，按形態(tài)特征異同進(jìn)行歸類(lèi)分組，然后從每組中選取1株作為代表菌株進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定，最后通過(guò)形態(tài)觀(guān)察與16S rDNA序列測(cè)定相結(jié)合的方法鑒定菌種。

(1)菌落形態(tài)特征觀(guān)察。采用劃線(xiàn)法[8]，將放線(xiàn)菌在高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上劃出單菌落，28 ℃培養(yǎng)7 d后，觀(guān)察放線(xiàn)菌菌落氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的顏色，是否產(chǎn)生可溶性色素及是否形成孢子絲等。

(2)16S rDNA序列測(cè)定。采用酶解法提取放線(xiàn)菌總DNA，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：超純水37.7 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 4.0 μL，引物各1.0 μL，Mg2+2.5 μL，Taq酶0.3 μL，DNA模板1.0 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火55 s，72 ℃延長(zhǎng)2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延長(zhǎng)10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。所得序列(GenBank序列號(hào)KF317972～KF318000)利用Blastn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，獲得最相近菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 4.0軟件按照最大同源性原則進(jìn)行排序，Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用自舉法(bootstrap)對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1 000 次。

1.2.3 CaCl2效應(yīng) 將CaCl2加入髙氏1號(hào)培養(yǎng)基后引起的放線(xiàn)菌數(shù)量及種類(lèi)的變化稱(chēng)為CaCl2效應(yīng)(Effect of CaCl2)，分別用ECa、ΔECa表示，其計(jì)算公式為：

式中：GCa及G分別表示高氏1號(hào)加鈣培養(yǎng)基及高氏1號(hào)培養(yǎng)基中放線(xiàn)菌的數(shù)量(CFU/g)或種類(lèi)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.0軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaCl2對(duì)土壤可培養(yǎng)放線(xiàn)菌和鏈霉菌數(shù)量的影響

CaCl2對(duì)土壤可培養(yǎng)放線(xiàn)菌總數(shù)和鏈霉菌數(shù)量的影響見(jiàn)表2。

注：“*”表示2種培養(yǎng)基上可培養(yǎng)放線(xiàn)菌總數(shù)及鏈霉菌數(shù)量的差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。

Note:“*” stands for significant (P<0.05) difference in culturable actinomycete and streptomycete counts between two tested media.

從表2可以看出，向高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加CaCl2可減少供試土壤中可培養(yǎng)放線(xiàn)菌總數(shù)及鏈霉菌數(shù)量，10種土壤的放線(xiàn)菌總數(shù)減少了8.9%～70.1%，其中2、3、5、8、9號(hào)土樣的放線(xiàn)菌總數(shù)在2種培養(yǎng)基中的差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)；10種土壤的鏈霉菌數(shù)量減少12.5%～79.0%，其中1、3、7、9、10號(hào)土樣的鏈霉菌數(shù)量在2種培養(yǎng)基中的差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。在高氏1號(hào)加鈣培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，除上述土樣以外其余土樣中的放線(xiàn)菌總數(shù)或鏈霉菌數(shù)量均有所減少，但與高氏1號(hào)培養(yǎng)基相比差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

2.2 CaCl2對(duì)土壤放線(xiàn)菌種類(lèi)的影響

從表3可以看出，高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入CaCl2后，對(duì)10種土壤可培養(yǎng)放線(xiàn)菌的種類(lèi)均有一定影響。在高氏1號(hào)加鈣培養(yǎng)基上，從1、2、3、8、10號(hào)5個(gè)供試土壤分離到的放線(xiàn)菌種類(lèi)較高氏1號(hào)培養(yǎng)基減少了1～9種，從4、6、7、9號(hào)4個(gè)供試土壤分離到的放線(xiàn)菌種類(lèi)較高氏1號(hào)培養(yǎng)基增加了1～6種。

從表3還可以看出，向高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加CaCl2后，10種供試土壤中新出現(xiàn)了6～16種(合并共90種)在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的放線(xiàn)菌，同時(shí)有3～20種可在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的放線(xiàn)菌消失。以上結(jié)果表明，向高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入CaCl2可以激活某些在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的放線(xiàn)菌孢子，獲得某些在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的新放線(xiàn)菌種類(lèi)，同時(shí)也會(huì)抑制一些放線(xiàn)菌種類(lèi)的孢子萌發(fā)及生長(zhǎng)，使其消失，但其機(jī)理尚不清楚。

2.3 加入CaCl2后土壤新出現(xiàn)放線(xiàn)菌種類(lèi)的鑒定

本研究對(duì)獲得的90種新出現(xiàn)放線(xiàn)菌，按其形態(tài)特征異同進(jìn)行歸類(lèi)、分組后共得到29組，從每組中選取1株作為代表菌株，對(duì)這29株新出現(xiàn)放線(xiàn)菌的菌落形態(tài)特征和16S rDNA序列進(jìn)行鑒定和分析，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

注：“+”表示形成孢子絲；“-”表示不產(chǎn)色素或不形成孢子絲。

Note:“+” represents forming spore chain;“-” represents no spore chains or pigment.

注：“-”表示無(wú)生物活性。

Note:“-” represents no bioactivity.

從表5可以看出，在加入CaCl2后新出現(xiàn)且已鑒定的29株放線(xiàn)菌中，75.9%為鏈霉菌屬(Streptomyces)，17.2%為小單孢菌屬(Micromonospora)，其余為鏈孢囊菌(Streptosporangium)及野野村菌(Nonomuraea)。圖1為22株鏈霉菌屬放線(xiàn)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，圖2為7株非鏈霉菌屬放線(xiàn)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。此外，在已鑒定的29株放線(xiàn)菌中，有19株有抗菌或其他生物活性[8-16]，占已鑒定菌株的65.5%(表5)。以上結(jié)果表明，向高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加CaCl2，有利于從低鈣土壤中分離到新的鏈霉菌屬及小單孢菌屬放線(xiàn)菌，其中大部分菌株具有生物活性物質(zhì)合成功能及應(yīng)用價(jià)值。

2.4 加入CaCl2后放線(xiàn)菌數(shù)量、種類(lèi)變化與土壤性質(zhì)及海拔的關(guān)系

從表2和表3可知，向高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入CaCl2后，10種供試土壤中放線(xiàn)菌總數(shù)及種類(lèi)變化各不相同。對(duì)加入CaCl2后的放線(xiàn)菌數(shù)量和種類(lèi)變化與土壤性質(zhì)及土壤所處海拔的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表6。從表6可知，放線(xiàn)菌總數(shù)減少幅度與海拔顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.730；鏈霉菌數(shù)量減少幅度與海拔、土壤pH及碳酸鈣含量極顯著或顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.862，0.760及0.738；放線(xiàn)菌種類(lèi)數(shù)變化與土壤pH、碳酸鈣含量極顯著或顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.870，-0.727。

注：“*”、“**”分別表示相關(guān)性達(dá)到顯著水平(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)。

Note:“*”,“**” indicate significant difference atP<0.05 andP<0.01,respectively.

3 結(jié)論與討論

關(guān)于鈣對(duì)放線(xiàn)菌分離效果的影響，已有研究均采用碳酸鈣預(yù)處理土壤的方法來(lái)分離放線(xiàn)菌[3-5]，而將CaCl2加入培養(yǎng)基對(duì)放線(xiàn)菌進(jìn)行分離的研究很少，如Suzuki等[6]研究了培養(yǎng)基中加入CaCl2對(duì)放線(xiàn)菌菌絲生長(zhǎng)的影響，薛清等[7]研究了培養(yǎng)基中加入CaCl2對(duì)高碳酸鈣含量土壤放線(xiàn)菌分離效果的影響，但培養(yǎng)基中加入CaCl2對(duì)低碳酸鈣含量土壤放線(xiàn)菌的分離有何影響尚無(wú)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，向高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入CaCl2后，雖然減少了低鈣土壤中可培養(yǎng)放線(xiàn)菌的數(shù)量及種類(lèi)，但可以激活某些放線(xiàn)菌的孢子，獲得了一些在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的新鏈霉菌及小單孢菌，其中包括較多的可用于新醫(yī)藥及新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的活性物質(zhì)產(chǎn)生菌。由此可以推測(cè)，改變培養(yǎng)基中某種與微生物生長(zhǎng)代謝相關(guān)的無(wú)機(jī)成分，就可以改變土壤中可培養(yǎng)放線(xiàn)菌的數(shù)量及種類(lèi)，獲得新的放線(xiàn)菌種類(lèi)及活性物質(zhì)產(chǎn)生菌，該結(jié)果將為放線(xiàn)菌這一特殊自然資源的深度開(kāi)發(fā)利用提供新的途徑。但值得注意的是，采用此方法對(duì)放線(xiàn)菌進(jìn)行分離時(shí)，可能會(huì)抑制一些放線(xiàn)菌生長(zhǎng)，對(duì)此效果也要重視。

本研究結(jié)果表明，向高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入CaCl2后，對(duì)碳酸鈣含量不同土壤放線(xiàn)菌分離的效果影響不同。因此，在使用該方法時(shí)，應(yīng)根據(jù)研究目的和土壤碳酸鈣含量來(lái)決定是否需要加入CaCl2。若供試土壤碳酸鈣含量很低，研究目的是獲得盡可能多的放線(xiàn)菌及了解土壤放線(xiàn)菌的多樣性，則不必在高氏1號(hào)常規(guī)培養(yǎng)基中加CaCl2；當(dāng)研究目的是為了獲得新的放線(xiàn)菌種類(lèi)，開(kāi)發(fā)土壤中未知的放線(xiàn)菌資源，則可在高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加CaCl2；若供試土壤碳酸鈣含量較高，在高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加CaCl2則有利于增加可培養(yǎng)放線(xiàn)菌數(shù)量和種類(lèi)，并可以促進(jìn)土壤中具有廣譜抗菌活性放線(xiàn)菌資源的開(kāi)發(fā)[7]。

關(guān)于CaCl2對(duì)放線(xiàn)菌分離效果的影響機(jī)理，目前尚不清楚。有研究表明，培養(yǎng)基中一定濃度的Ca2+可以促進(jìn)或抑制部分放線(xiàn)菌氣生菌絲的形成和生長(zhǎng)[17]，因此初步推斷向培養(yǎng)基中加入Ca2+時(shí)，可能使放線(xiàn)菌孢子內(nèi)某些酶的活性或生化反應(yīng)受到影響，從而激活放線(xiàn)菌孢子，使原來(lái)不能萌發(fā)的孢子萌發(fā)，最終出現(xiàn)了新的種類(lèi)；同時(shí)也可能阻止了某些放線(xiàn)菌孢子的萌發(fā)及生長(zhǎng)，而使一些放線(xiàn)菌種類(lèi)消失，但該推測(cè)尚有待進(jìn)一步研究。

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Effect of CaCl2on number and type of culturable actinomycete in low calcium soils

WANG Dong-sheng1,2,XUE Quan-hong1,GAO Hui1,ZHANG Jun-hui1, MA Xin1,CHEN Jiao-jiao1

(1CollegeofNaturalResourcesandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2CollegeofLifeScience,ShanxiNormalUniversity,Linfen,Shanxi041004,China)

【Objective】 This study aimed to analyze the effects of CaCl2on number and type of culturable actinomycete in low CaCO3soils and develop a new isolation method for actinomycete.【Method】 Soil samples with different CaCO3contents were collected at different elevations from Taibai Mountain,Shaanxi Providence,China.The change in number and type of culturable actinomycete after adding CaCl2to Gause’s synthetic agar in low calcium soils was analyzed by isolating actinomycetes using soil dilution plate technique.The isolates cultured only on medium plus CaCl2were identified based on 16S rDNA sequence analysis.【Result】 Cultured actinomycete and streptomycete counts decreased and some actinomycete species disappeared in CaCl2treatment in all tested samples.A total of 90 actinomycete isolates were only isolated on Gause’s synthetic agar plus CaCl2.Based on the morphological characters and 16S rDNA sequence analysis,29 typical isolates were selected and they were mainlyStreptomycesspp. andMicromonosporaspp.,of which 65.5% showed bioactivities or other application values. 【Conclusion】 Supplement of CaCl2to Gause’s synthetic agar could isolate actinomycete species,including many types that could produce bioactive compounds.

CaCl2;mountain soil;actinomycete isolation;Gause’s synthetic agar

2013-09-11

教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IRT0748)

王東勝(1988-)，男，山西洪洞人，講師，博士，主要從事放線(xiàn)菌資源及生態(tài)研究。 E-mail:wangdongshengwdsh@163.com

薛泉宏(1957-)，男，陜西白水人，教授，碩士，主要從事放線(xiàn)菌資源及生態(tài)研究。 E-mail:xuequanhong@nwsuaf.edu.cn

時(shí)間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.018

S154.3

A

1671-9387(2015)01-0175-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.018.html