張 倩,王世祥,陳勇勇,馬曉毅,邊六交,岳 俏,鄭曉暉

(西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710069)

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·生命科學(xué)·

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定通竅鼻炎片中5種成分

張 倩,王世祥,陳勇勇,馬曉毅,邊六交,岳 俏,鄭曉暉

(西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710069)

建立RP-HPLC 法同時(shí)測(cè)定通竅鼻炎片中花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素的含量。Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為0.2%甲酸水(A)—乙腈(B),梯度洗脫(0～42 min,22% B;43～72 min,50% B);柱溫30℃;進(jìn)樣量50 μL,流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm?；ń范痉釉?.163～5.216 μg/mL (r2=0.999 8),水合氧化前胡素在0.699～22.356 μg/mL (r2=0.999 5),白當(dāng)歸素在0.375～11.988 μg/mL (r2=0.999 8),歐前胡素在1.617～51.744 μg/mL (r2=0. 999 3),異歐前胡素在0.869～27.784 μg/mL (r2=0.999 8)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系,平均回收率均大于95%。該方法準(zhǔn)確可靠,可行性及重復(fù)性良好,可作為通竅鼻炎片的質(zhì)量控制方法。

通竅鼻炎片;含量測(cè)定;RP-HPLC

通竅鼻炎片是由蒼耳子、白芷、黃芪等7味中藥組成,具有散風(fēng)固表、宣肺通竅的作用,用于慢性鼻炎、過(guò)敏性鼻炎、鼻竇炎等疾病治療[1]。本處方中白芷含有香豆素、揮發(fā)油和糖苷類有效成分[2],部分香豆素類組分及異歐前胡素、歐前胡素、水合氧化前胡素和白當(dāng)歸素等成分具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛和解痙攣等作用,其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與抑制NO的合成或釋放有關(guān)[3-6]。目前對(duì)于通竅鼻炎片的質(zhì)量控制僅集中于歐前胡素、異歐前胡素、5-O-甲基維斯阿米醇苷等一種或兩種成分的含量測(cè)定[7-8],對(duì)花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素的同時(shí)測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用 RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定通竅鼻炎片中的花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素的含量,旨在為通竅鼻炎片質(zhì)量控制提供參考方法。

1 材 料

1.1 儀 器

Agilent 1200 系列高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);XS105DU 型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Maxima 超純水機(jī)(美國(guó)基因公司)。

1.2 藥品與試劑

通竅鼻炎片(規(guī)格為12片/板,3板/盒,每片0.30 g。吉林吉春制藥股份有限公司,批號(hào):130503;四平市吉特藥業(yè)有限公司,批號(hào):20121104;修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,批號(hào):130501;通化斯威藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):130901;成都地奧集團(tuán)天府藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):130101);花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素、異歐前胡素對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號(hào)分別為:121121,130520,121102,120903,121209);色譜乙腈(美國(guó) Fisher公司);其他試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為0.2%甲酸水(A)—乙腈(B),梯度洗脫(0～42 min,22% B;43～73 min,50% B);檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量50 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取花椒毒酚3.26 mg、水合氧化前胡素4.14 mg、白當(dāng)歸素1.11 mg、歐前胡素2.94 mg、異歐前胡素1.51 mg分別置于10 mL容量瓶,并以甲醇定容至刻度線,即得花椒毒酚326 μg/mL、水合氧化前胡素414 μg/mL、白當(dāng)歸素111 μg/mL、歐前胡素294 μg/mL和異歐前胡素151 μg/mL對(duì)照品溶液。分別精密量取各對(duì)照品溶液適量于25 mL容量瓶,并以甲醇定容。即得含花椒毒酚5.216 μg/mL、水合氧化前胡素22.356 μg/mL、白當(dāng)歸素11.988 μg/mL、歐前胡素51.744 μg/mL、異歐前胡素27.784 μg/mL的混合對(duì)照品溶液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備

取本品10片,除去糖衣和粉衣,研成細(xì)粉,取粉末0.6 g,精密稱定,至于50 mL具塞錐形瓶,向瓶中加入70%甲醇20 mL,超聲提取20 min。提取液濾過(guò),藥渣用70%甲醇洗滌2次,每次2 mL,合并濾液并移至25 mL容量瓶中,并用70%甲醇定容,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),4℃冷藏備用。

2.4 陰性供試品溶液的制備

花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素來(lái)源于白芷,按藥典中通竅鼻炎片的生產(chǎn)工藝[1]制備缺白芷的陰性制劑,并按照2.3 項(xiàng)下所述方法制備陰性供試品溶液。

3 結(jié) 果

3.1 專屬性

在擬定的色譜條件下對(duì)供試品溶液進(jìn)行分析,花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素與其他組分的色譜峰均可基線分離 (分離度大于1.5),且陰性供試品無(wú)干擾。混合對(duì)照品、供試品和陰性供試品色譜圖見(jiàn)圖 1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

3.2 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,用甲醇配制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液在擬定的色譜條件下對(duì)上述混合對(duì)照品溶液進(jìn)行分析,以濃度(μg/mL)作為橫坐標(biāo),相應(yīng)色譜峰面積作為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y=183.42X-4.038 6(r2=0.999 8);Y=120.47X+17.103(r2=0.999 5);Y=70.514X+8.651(r2=0. 999 8);Y=157.65X+131.51(r2=0. 999 3);Y=128.04X+43.092(r2=0. 999 8)。結(jié)果表明,花椒毒酚在0.163～5.216μg/mL,水合氧化前胡素在0.699～22.356μg/mL,白當(dāng)歸素在0.375～11.988μg/mL,歐前胡素在1.617～51.744μg/mL,異歐前胡素在0.869 ～27.784μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液50μL,連續(xù)進(jìn)樣 5 次,花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素的RSD值分別為2.12%,1.96%,2.38%,2.73%,1.39%,表明儀器精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取通竅鼻炎片粉末(批號(hào):130501)6份,分別依照 2.3 項(xiàng)下所述方法制備供試品溶液,并在擬定的色譜條件下分別進(jìn)行分析。花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素峰面積的RSD值分別為2.25%,1.94%,2.37%,2.81%,2.19%,表明供試品重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取通竅鼻炎片粉末(批號(hào):130501)0.60028g,按照 2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并在室溫下放置0,2,4,6,8,10,12h,在擬定的色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定?；ń范痉?、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素面積的RSD值分別為2.03%,1.92%,2.86%,2.61%,2.25%,表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取通竅鼻炎片粉末(批號(hào):130501)0.3g,平行稱取6份，分別加入2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液3.1mL,按照 2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在擬定的色譜條件下進(jìn)樣分析,并計(jì)算各組分加樣回收率。顯示花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素的平均回收率分別為97.81%±2.18%，96.95%±3.01%，98.47%±3.57%，100.48%±2.56%和97.95%±1.99%，表明該樣品處理方法可靠。

3.7 樣品的測(cè)定

取不同廠家生產(chǎn)的通竅鼻炎片粉末,分別按照2.3項(xiàng)下所述方法制備供試品溶液,在擬定的色譜條件下進(jìn)樣分析,每批樣品平行測(cè)定3次并記錄峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各待測(cè)組分含量,結(jié)果見(jiàn)表1。

本實(shí)驗(yàn)從各藥房購(gòu)得 5 種不同廠家生產(chǎn)的通竅鼻炎片,并對(duì)其中各待測(cè)成份的含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示,不同廠家生產(chǎn)的通竅鼻炎片中這 5 種成分含量存在差異(表1)?；ń范痉?、水合氧化前胡素和白當(dāng)歸素均為成都地奧生產(chǎn)的含量最高;歐前胡素和異歐前胡素均為四平吉藥生產(chǎn)的含量最高。由于每片通竅鼻炎片所含白芷以歐前胡素含量計(jì),且不得少于60μg[1],因此本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的 5 個(gè)廠家和批號(hào)的樣品均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

4 討 論

根據(jù)國(guó)家和企業(yè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),通竅鼻炎片的質(zhì)量控制方法目前僅局限于對(duì)歐前胡素的含量測(cè)定,這對(duì)于復(fù)方制劑來(lái)說(shuō)不能夠全面的控制其質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定通竅鼻炎片中的花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素的含量,該法不僅簡(jiǎn)便而且重復(fù)性良好,以期為提高和完善通竅鼻炎片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表1 通竅鼻炎片有效成分的測(cè)定Tab.1 Determination of components in TongqiaoBiyanTablets

4.1 提取方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別采用純水、50%甲醇、70%甲醇作為提取溶劑，研究了不同提取溶劑對(duì)樣品中各待測(cè)組分溶出的影響，結(jié)果顯示,以70%甲醇超聲提取時(shí),各測(cè)定成份的含量最高。為了研究提取時(shí)間對(duì)藥物中各待測(cè)組分溶出的影響,實(shí)驗(yàn)分別考察了15,20和30 min作為提取時(shí)間。結(jié)果表明,各組分在20 min與30 min的提取結(jié)果基本相同,因此最終選擇70%甲醇超聲提取20 min作為樣品最佳提取方法。

4.2 色譜條件選擇

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)流動(dòng)相的不同配比(15～75%乙腈)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,乙腈-0.2%甲酸水溶液作為溶劑系統(tǒng),以22%乙腈洗脫時(shí),水合氧化前胡素和白當(dāng)歸素的峰形和分離度最好;以50%乙腈洗脫時(shí),歐前胡素和異歐前胡素具有較好的峰形和最佳的分離度。因此,本實(shí)驗(yàn)采取上述梯度進(jìn)行洗脫,以實(shí)現(xiàn)在分析周期內(nèi)各待測(cè)成分盡可能達(dá)到最佳的分離度。

4.3 含量差異分析

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同廠家生產(chǎn)的通竅鼻炎片中5種成分含量,表1顯示該5種成分含量存在差異。這可能與該制劑中的白芷是以生藥粉末入藥有關(guān)。因?yàn)楦魃a(chǎn)廠家用于生產(chǎn)該制劑的白芷生藥產(chǎn)地不同,生長(zhǎng)地域的溫度、濕度、光照等條件也存在著差異,所以生長(zhǎng)環(huán)境不同的白芷生藥粉末中相應(yīng)成分的含量可能存在差異。而這些生長(zhǎng)條件如何影響白芷中相應(yīng)成分的含量有待于進(jìn)一步研究。

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(編 輯徐象平)

Simultaneous determination of five components in Tongqiao Biyan Tablets by RP-HPLC

ZHANG Qian, WANG Shi-xiang, CHEN Yong-yong, MA Xiao-yi, BIAN Liu-jiao, YUE Qiao, ZHENG Xiao-hui

(College of Life Sciences, Northwest University, Xi′an 710069， China)

To establish a RP-HPLC method for simultaneously determining xanthotoxol, hydrate oxypeucedanin, byakangelicin, imperatorin and isoimperatorin in Tongqiao Biyan Tablets. The analysis was performed on Agilent TC-C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm), and the mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% formic acid with step gradient elution. The flow rate was 1 mL/min and detection wavelengths was set at 254 nm. The samples showed a good relationship in the ranges of 0.163～5.216 μg/mL for xanthotoxol (r2=0.999 8), 0.699～22.356 μg/mL for hydrate oxypeucedanin (r2=0.999 5),0.375～11.988 μg/mL for byakangelicin (r2=0.999 8), 1.617～51.744 μg/mL for imperatorin (r2=0.999 3) and 0.869～27.784 μg/mL for isoimperatorin (r2=0.999 8). All of the average recoveries were more than 95%. The method is accurate, reliable and reproducible and can be used for quality control of Tongqiao Biyan Tablets.

Tongqiao Biyan Tablets; content determination; RP-HPLC

2014-03-11

陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2010JM4047);西北大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(2012099)

張倩，女，陜西西安人，從事中藥代謝與分析研究。

王世祥，男，陜西楊凌人，西北大學(xué)副教授，從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

R987

：ADOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2015-02-016