田 嬌,吳 洋,劉 園,黨悅方,岳 明,房敏峰

(西北大學 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室/生命科學學院, 陜西 西安 710069)

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·生命科學·

光照強度對遠志生長及口山酮類成分積累的影響

田 嬌,吳 洋,劉 園,黨悅方,岳 明,房敏峰

(西北大學 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室/生命科學學院, 陜西 西安 710069)

建立遠志口山酮類成分含量測定方法,考察光照強度對遠志生長發(fā)育及口山酮類成分積累的影響。方法:待遠志幼苗生長至8-10片真葉時,采用市售遮陰網(wǎng)分3組處理,包括自然光照組、單層遮陰網(wǎng)組(30%自然光照)和雙層遮陰網(wǎng)組(10%自然光照),處理后第15 d，30 d和60 d分別采樣測定口山酮類成分含量及相關(guān)生理指標,GraphPad Prism 5 和SPSS17.0軟件作圖分析。結(jié)果:短期遮陰能提高遠志根部口山酮類成分和地上總黃酮含量,但長期遮陰后,遠志根部口山酮類含量和產(chǎn)量均受到抑制;長期遮陰后葉面積和地上部分干重顯著升高(P<0.05),而根干重顯著下降(P<0.05)。強光照能提高遠志藥用部位口山酮類含量和產(chǎn)量,而遮陰能提高地上部分芒果苷含量。

口山酮;遠志;光照強度

光照強度對植物次生代謝物含量影響顯著,尤其是黃酮類成分[1-3]。不同植物中黃酮的合成和積累對光照強度的需求不一致,因此根據(jù)植物的需求來調(diào)整光強,可改變其黃酮含量。遠志PolygalatenuifoliaWilld.為喜光植物,體內(nèi)含有一類結(jié)構(gòu)特殊的黃酮類成分—口山酮,基本母核由苯環(huán)與色原酮的2，3位駢合而成,又稱苯并吡酮類。迄今在遠志中發(fā)現(xiàn)30多種口山酮類成分,具有止痛、抗菌、抗抑郁等活性[4],其代表性成分遠志口山酮Ⅲ或芒果苷的HPLC測定方法也見報道[5-6],但光照強度對遠志口山酮類成分的影響尚未見報道。因此,本文考察了光照強度對遠志生理生化及口山酮類成分的影響,以期為遠志的人工栽培提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 植物材料

遠志種子購于陜西合陽縣水車頭村,經(jīng)西安市食品藥品檢驗所謝志民研究員鑒定為合陽栽培遠志PolygalatenuifoliaWilld.的3年生種子,貯存于干燥通風處,測得發(fā)芽率為82 %。

1.2 儀器和試劑

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司);U-3310紫外-可見分光光度計(日本日立公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);TGL-16G高速離心機(上海安寧科學儀器公司);USB4000-UV-VIS Ocean Optics 光纖光譜儀(美國海洋光學公司)。

遠志口山酮Ⅲ對照品(批號:ps10091301,購自成都普思生物科技有限公司);芒果苷對照品(批號:111607-200402,購自中國藥品生物制品檢驗所);乙腈、甲醇(色譜純,美國Fisher公司);蒸餾水;其他試劑均為分析純。

2 方 法

遠志種子直播于聚乙烯塑料盆中,待幼苗生長至8-10片真葉時,采用市售遮陰網(wǎng)分3組處理,包括自然光照組、單層遮陰網(wǎng)組(30%自然光照)和雙層遮陰網(wǎng)組(10%自然光照),每組10盆,處理后第15 d、30 d和60 d分別采集樣品,80℃烘干,用于口山酮類成分含量測定。處理60 d時,隨機選取長勢一致的植株進行葉面積和生物量測定。

2.1 遠志口山酮Ⅲ和芒果苷的含量測定

色譜條件:色譜柱為GL Inertsil ODS-SP C18(4.6 mm×250 mm, 5μm);流動相為乙腈(0.03%磷酸)-水(0.03%磷酸)系統(tǒng),洗脫條件為:0～13 min:18%乙腈;13～28 min:26%乙腈;28～46 min:32%乙腈;46～52 min:60%乙腈;檢測波長:320 nm;進樣量:10 μL;柱溫:30 ℃;流速:0.8 mL/min。以峰面積為縱坐標,對照品濃度(mg/mL)為橫坐標,得遠志口山酮Ⅲ回歸方程為Y=3E+07X-20 510,R2=0.999 7,表明遠志口山酮Ⅲ在0.005～1.000 mg/mL線性關(guān)系良好;芒果苷回歸方程為Y=28 717X+15 730,R2=0.999 7,表明芒果苷在0.9～360 μg/mL線性關(guān)系良好。精密稱取遠志根部、地上部分樣品粉末各0.1 g,加40倍量60%(體積分數(shù))甲醇超聲提取45 min,離心,取上清液定容至3 mL,即為供試品溶液,取樣品溶液10 μL進樣,根據(jù)回歸方程計算含量。測定結(jié)果如圖1所示。

2.2 遠志總黃酮含量測定

采用Al(NO3)3顯色法測定遠志總黃酮含量。以吸光度為縱坐標,對照品溶液濃度(mg/mL)為橫坐標,得遠志口山酮Ⅲ回歸方程為Y=21.311X-0.006 4,R2=0.999 1,表明遠志口山酮Ⅲ在0.0～0.04 mg/mL線性關(guān)系良好;芒果苷回歸方程為Y=43.347X-0.006 5,R2=0.999 0,表明芒果苷在0.0～0.02 mg/mL線性關(guān)系良好。分別精密吸取適量的遠志根部和地上樣品溶液,60%(體積分數(shù))甲醇定容至2.0 mL,并加入0.5 mL 10%(體積分數(shù))Al(NO3)3,40 ℃顯色10 min后,60%(體積分數(shù))甲醇定容至6.0 mL,搖勻,分別在400 nm和415 nm測定吸光度,根據(jù)回歸方程計算總黃酮含量。

圖1 遠志根部、地上樣品提取液的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of extract in the root and shoot of Polygala tenuifolia Willd.

3 結(jié)果與分析

3.1 光照強度對遠志葉面積及生物量的影響

隨機采集3組遠志植株頂端葉片各45片,計算各組面積。如圖2所示。

圖2 光照強度對遠志幼苗葉面積和生物量的影響Fig. 2 Effect of light intensity on leaf area and mass of seedlings of Polygala tenuifolia Willd.

由圖2可見,隨光照強度減弱,葉面積和地上部分干重增加,但根部干重和總生物量降低。提示長期遮陰后,植株生物量分配更趨于地上部分,降低了藥用部位(根)的產(chǎn)量。

3.2 光照強度對遠志口山酮類成分含量的影響

黃酮類是植物抗氧化抗腫瘤活性成分。遠志口山酮Ⅲ是遠志根部口山酮的代表性成分,地上部分則為芒果苷,口山酮Ⅲ含量極微。光強對其影響見表1。

表1可見,短期遮陰(15d)能同時提高遠志根部總黃酮及口山酮Ⅲ含量(P<0.05),降低地上部分總黃酮含量(P<0.05);長期遮陰(60d)根部總黃酮含量幾無變化(P<0.05),但根部口山酮Ⅲ含量顯著下降(P<0.05),地上芒果苷含量顯著升高(P<0.05)。

表1 光照強度對遠志口山酮類成分含量的影響Tab.1 Effect of light intensity on the content of the xanthones in Polygala tenuifolia Willd.

3.3 光照強度對遠志口山酮類成分產(chǎn)量的影響

遠志中口山酮類成分的產(chǎn)量即口山酮類含量與生物量的乘積,見圖3。處理60 d時,隨光照強度減弱,根部總黃酮和遠志口山酮Ⅲ產(chǎn)量降低;地上部分芒果苷產(chǎn)量升高,總黃酮在30%自然光照強度下降低,但當光照強度降低到10%時,回復(fù)到自然光照水平。提示長期高度遮陰促進地上部分芒果苷產(chǎn)量,抑制根部總黃酮及口山酮Ⅲ產(chǎn)量。

圖3 光照強度對遠志口山酮類成分產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of light intensity on the production of xanthones in Polygala tenuifolia Willd.

4 討 論

4.1 遠志總黃酮含量測定方法的建立

NaNO2-A1(NO3)3-NaOH 比色法是總黃酮測定的常用方法,但存在一定局限性[7]?？谏酵Y(jié)構(gòu)特殊,穩(wěn)定性較高,不易開環(huán)與堿液反應(yīng),因此,NaNO2-A1(NO3)3-NaOH 比色法不適合遠志總黃酮的含量測定,而實驗中采用Al(NO3)3顯色后測定遠志總黃酮含量,準確、穩(wěn)定、重復(fù)性高。

4.2 光照強度對遠志生長及口山酮類含量和產(chǎn)量的影響

實驗結(jié)果顯示,長期遮陰有利于遠志地上部分生物量積累,表明遠志對蔭蔽環(huán)境有一定的適應(yīng)性,但長期遮陰不利于遠志的正常發(fā)育和藥用部位的積累,導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化加劇,嚴重者還會導(dǎo)致植株的死亡。短期遮陰對遠志中口山酮類成分的積累具有促進作用,但長期遮陰后,根部口山酮類成分的含量和產(chǎn)量均受到抑制。綜上所述,強光照有利于遠志的生長及其藥用部位口山酮類成分的合成與積累。

4.3 遠志地上資源開發(fā)探索

本實驗測得1年生遠志幼苗地上部分含芒果苷1.02 %(質(zhì)量分數(shù)),李學堅等[8]報道了芒果苷在芒果葉、芒果樹皮和芒果果實中的質(zhì)量分數(shù)分別為2.08%，0.38%和2.31%,由于芒果苷具有抗病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[9-10],說明遠志地上部分具有一定的藥用價值。但是，在實際生產(chǎn)中,遠志地上部分常被視為非藥用部位而丟棄,造成大量的資源浪費。因此,本研究可以為遠志資源的綜合開發(fā)研究提供思路。

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(編 輯陳鐿文)

Effects of light intensity on xanthones accumulation and biomass inPolygalatenuifoliaWilld.

TIAN Jiao, WU Yang, LIU Yuan, DANG Yue-fang, YUE Ming, FANG Min-feng

(Key Laboratory of Resource Biological and Biotechnology in Western China/College of Life Sciences, Northwest University, Xi′an 710069， China)

To establish a method to determine the content of xanthones inPolygalatenuifoliaWilld. and study the effects of light intensity on growth and xanthones accumulation inPolygalatenuifoliaWilld. The seedlings were under different treatments, including natural light group, single shading network group (30% natural light) and double shading network group (10% natural light), collected after 15 d, 30 d and 60 d respectively, then detected the content of xanthones and physiology characteristics inPolygalatenuifoliaWilld.The accumulation of xanthones were improved in the root ofPolygalatenuifoliaWilld. and the total flavonoids in the shoot ofPolygalatenuifoliaWilld. under the short shading condition. But on the long term shading condition, the accumulation and production of xanthones in the root ofPolygalatenuifoliaWilld. were both inhibited. Besides, leaf area and dry weight of the shoot were enhanced significantly under the long term shading condition(P<0.05), but dry weight of the root was reduced significantly(P<0.05). The strong light is conducive to the accumulation of xanthones in the medicinal part ofPolygalatenuifoliaWilld., but shading can enhance the content of mangiferin in the shoot ofPolygalatenuifoliaWilld., which provides reference for the artificial cultivation and the medicinal resources development ofPolygalatenuifoliaWilld.

xanthones;PolygalatenuifoliaWilld.; light intensity

2014-05-11

陜西省科技廳社發(fā)攻關(guān)基金資助項目(2013K14-03-02);陜西省教育廳自然科學專項基金資助項目(2013JK0808);陜西省中醫(yī)藥管理局專項基金資助項目(13-ZY052);教育部重點實驗室開放基金資助項目(ZS12012)

田嬌,女,陜西西安人,從事中藥生態(tài)化學研究。

房敏峰,女,陜西商州人，西北大學教授，從事中藥資源與炮制研究。

R282.2

：ADOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2015-02-018