譚紅麗,郭 英,楊文艷,陳福美,張福新,張正飛,王 鵬

麗江市古城區(qū)首次證實(shí)一起鼠間鼠疫疫情

譚紅麗1,3,郭 英1,楊文艷2,陳福美2,張福新2,張正飛2,王 鵬1

目的 對(duì)麗江市古城區(qū)的一起鼠間鼠疫進(jìn)行判定。方法 對(duì)1份干燥自斃大絨鼠標(biāo)本進(jìn)行鼠疫反相間接血凝抑制試驗(yàn)(RIHA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)。結(jié)果 該標(biāo)本經(jīng)免疫學(xué)檢測(cè)、PCR及RT-PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性。結(jié)論 確認(rèn)麗江市古城區(qū)鼠間鼠疫疫情。

鼠疫;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;自斃鼠;麗江市古城區(qū)

2005年10-11月間，云南省麗江市玉龍縣黃山鎮(zhèn)南溪村委會(huì)鹿子村發(fā)生一起聚集性5人發(fā)病，其中2人死亡的肺鼠疫事件，次年11月從鹿子村揀獲的自斃鼠中分離到了鼠疫菌，從而證實(shí)了玉龍縣鼠疫自然疫源地的存在[1]。

2014年5月7日麗江市玉龍縣黃山鎮(zhèn)再次發(fā)生鼠間鼠疫。為進(jìn)一步明確此次疫情的疫區(qū)范圍，進(jìn)行了大規(guī)模的自斃鼠搜索。2014年5月15日，在麗江市七河鎮(zhèn)后山村委會(huì)木梳自然村揀獲了1只自斃大絨鼠，對(duì)該標(biāo)本進(jìn)行了F1抗原免疫學(xué)檢測(cè)、PCR和RTPCR檢測(cè)，操作按常規(guī)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 結(jié) 果

1.1 反相血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)該標(biāo)本膠體經(jīng)初篩結(jié)果呈強(qiáng)陽(yáng)性見(jiàn)圖1-A，同時(shí)進(jìn)行了反相血凝抑制試驗(yàn)(RIHA)，結(jié)果顯示：在首孔為1∶80稀釋度時(shí)，血凝列陽(yáng)性達(dá)到6孔，同時(shí)抑制列只有前兩孔陽(yáng)性，4孔被抑制，而單寧酸列全為陰性，綜合判斷其鼠疫F1抗原特異效價(jià)為1∶2 560，見(jiàn)圖1-B。

1.2PCR結(jié)果 根據(jù)鼠疫診斷衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS279-2008)，以鼠疫菌的fra(249bp)與pla(456bp)二對(duì)基因的片段作為PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因，結(jié)果為陽(yáng)性見(jiàn)圖2。

圖1 鼠疫F1抗原免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Plague F1 antigen immunoassay results

1.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 該標(biāo)本caf1、pla及YPO0392三對(duì)基因皆出現(xiàn)陽(yáng)性峰圖，其中pla出現(xiàn)峰圖最早，caf1與YPO0392較遲，且Ct值與模板量成正相關(guān)，即2 μL標(biāo)本DNA的Ct值較1 μL標(biāo)本DNA的Ct值要小。見(jiàn)圖3。

圖2 PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因結(jié)果Fig.2 Results of target gene PCR amplification

圖3 采用鼠疫三對(duì)特異基因?qū)?biāo)本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖Fig.3 The PCR RT-test results of the specimens were carried out using three pairs of specific genes of plague

2 討 論

2.1 麗江古城區(qū)首次證實(shí)鼠間鼠疫疫情 麗江市古城區(qū)位于云南省西北部橫斷山脈向云貴高原過(guò)渡地帶，下轄金山、七河、金江、金安、大東5個(gè)鄉(xiāng)和大研、西安、束河、祥和4個(gè)街道，共53個(gè)村(居)委會(huì)，總?cè)丝?4.2萬(wàn)人，有納西、漢、白、藏、彝、普米等10余個(gè)民族。古城區(qū)為滇西北通向川、藏連接內(nèi)地的樞紐，麗江機(jī)場(chǎng)位于古城區(qū)的七河鄉(xiāng)，為口岸機(jī)場(chǎng)，目前已開(kāi)通多條國(guó)內(nèi)航線。

此次證實(shí)的鼠疫疫點(diǎn)位于七河鎮(zhèn)的木梳村，離2005年人間鼠疫疫點(diǎn)鹿子村只有5 km，從地理上講是同一片區(qū)域，只是人為行政區(qū)劃為兩個(gè)縣。麗江機(jī)場(chǎng)雖在七河鄉(xiāng)，但木梳離機(jī)場(chǎng)的直線距離達(dá)12 km，作為鼠疫宿主的齊氏姬鼠和大絨鼠主要棲居于山區(qū)的原生林、次生林及農(nóng)耕區(qū)，對(duì)于地處壩區(qū)現(xiàn)代城鎮(zhèn)，則不是野鼠的棲居之所，因此山區(qū)農(nóng)耕區(qū)的農(nóng)民接觸鼠疫的幾率大于壩區(qū)居民，因此從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的農(nóng)民是我們健康教育的重點(diǎn)人群。

2.2 采用RT-PCR替代普通PCR 2008年9月新修訂了鼠疫診斷衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS279-2008)[2]，對(duì)沒(méi)有分離到鼠疫菌的疑似標(biāo)本，除免疫學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性外，還要求基因檢測(cè)陽(yáng)性，方可作出診斷。在現(xiàn)場(chǎng)工作時(shí)，快速準(zhǔn)確的診斷尤為重要?，F(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)中所提供的基因檢測(cè)方法是普通PCR方法，隨著技術(shù)的進(jìn)步，RT-PCR越來(lái)越成為疾病診斷的主流方法，而在鼠疫診斷上也早有報(bào)道[3-4]。本實(shí)驗(yàn)采用鼠疫caf1及pla兩個(gè)特異基因的引物與探針成功擴(kuò)增出片段，并同時(shí)采用了鼠疫染色體上的一個(gè)標(biāo)識(shí)基因[5]進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與普通pcr相符，其診斷時(shí)間比傳統(tǒng)的PCR要節(jié)約2 h。

本次研究中pla出現(xiàn)峰圖較早，而caf1與 YPO0392較遲，這正精確反映了鼠疫基因組的情況，caf1基因位于鼠疫菌的PMT1質(zhì)粒上，而該質(zhì)粒在鼠疫菌中是單拷貝的；YPO0392位于染色體上，鼠疫菌中也只有一條染色體；pla基因則位于鼠疫菌pPCP1質(zhì)粒上，該質(zhì)粒在鼠疫菌中是多拷貝的。這就是說(shuō)，對(duì)于一定的菌量，pla基因的拷貝數(shù)要大大多于caf1與 YPO0392基因的拷貝數(shù)的，即在RT-PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，理論上講，前者的Ct值要比后兩者的小，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也很好地與此理論相符。

總之，本次實(shí)驗(yàn)中RT-PCR的成功應(yīng)用為今后鼠疫現(xiàn)場(chǎng)診斷又提供了一個(gè)成功案例，并可以預(yù)測(cè)在今后鼠疫的基因診斷中，RT-PCR替代普通PCR將成為趨勢(shì)。

(對(duì)參加麗江鼠疫疫情處理的古城區(qū)CDC、玉龍縣CDC、麗江市CDC及云南省地方病防治所的同志們表示誠(chéng)摯感謝！)

[1]Guo Y, Zhang LY, Xia LX, et al. Biochemical characters ofYersiniapestisisolated from Yulong County of Yunnan Province in China[J]. Endem Dis Bull, 2008, 23(3): 12-14. (in Chinese) 郭英,張麗云,夏連續(xù),等. 云南省玉龍縣鼠疫菌的生化特性[J]. 地方病通報(bào), 2008,23(3):12-14.

[2]Diagnostic criteria of Plague (WS279-2008) / health industry standards of the people’s Republic of China (ISBN: 14117208)[S]. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2008.(in Chinese) 鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS279-2008) /中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(ISBN：14117208)[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

[3]Zhang ZK, Hai R, Cai H, et al. Detection ofYersiniapestismultiplex polymerase chain teaction [J]. Chin J Infect Ctrl, 2007, 26 (5): 475-477. (in Chinese) 張志凱，海榮，蔡虹，等. 多重PCR檢測(cè)方法在鼠疫監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)地方病學(xué)雜志,2007,26(5):475-477.

[4]Li W, Hai R, Yu DZ, et al. Detection ofYersiniapestisfrom mice tissues and soil by real-time fluorescence polymerase chain teaction[J]. Chin J Vector Biol Ctrl, 2005, 16(4): 301-304. (in Chinese) 李偉，海榮，俞東征，等. 應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)環(huán)境樣品中鼠疫耶爾森菌[J].中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志,2005,16(4):301-304.

[5]Han YP, Zhou DS, Song YJ, et al. Detection of DNA tag sequences for rapid identification ofYersiniapestis[J]. Med J Chin PLA, 2004, 29(4): 307-309. (in Chinese) 韓延平，周冬生，宋亞軍，等. 鼠疫耶爾森菌DNA標(biāo)識(shí)序列的鑒定及其應(yīng)用研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2004,29(4)：307-309.

Determination of a rat plague epidemic in ancient city administrative region of Lijiang, China

TAN Hong-li1,3,GUO Ying1,ZHANG Fu-xin2,YANG Wen-yang2,CHEN Fu-mei2,ZHANG Zheng-fei2, WANG Peng1

(1.YunnanProvincialKeyLaboratoryforZoonosisControlandPrevention,YunnanInstituteforEndemicDiseaseControlandPrevention,Dali671000,China;2.LijiangCenterforDiseaseControlandPrevention,Lijiang674100,China;3.SchoolofPublicHealth,DaliUniversity,Dali67100,China)

To determine a rat plague epidemic in ancient city administrative region of Lijiang, China, one of drying self-deadEothenomysmiletuswere detected with methods of reverse indirect hemoagglutination inhibition test (RIHA), Polymerase Chain Reaction (PCR) and real-time PCR (RT-PCR). Results showed that the immunological detection, PCR and RT-PCR detection to this sample were positive. It was confirmed that a rat plague epidemic occurred in ancient city administrative region of Lijiang.

plague; real time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR); self-dead rodent; ancient city administrative region of Lijiang

Wang Peng, Email: wp03801@126.Com

王鵬，Email：wp030801@126.com

1.云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大理 671000； 2.麗江市疾病預(yù)防控制中心 云南 麗江674100; 3.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,大理 671000

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.021

R516.8

A

1002-2694(2015)11-1086-03

2015-01-16；

2015-03-17