吳 亮，王 曉，蘇丹華，劉 原，付 濤，姜旭淦，陳盛霞，曹建平

弓形蟲入侵的宿主細胞骨架重塑觸發(fā)線粒體重新分布

吳 亮1,2，王 曉2，蘇丹華2，劉 原2，付 濤2，姜旭淦2，陳盛霞2，曹建平1

目的 探討宿主細胞骨架重塑在弓形蟲侵入HFF細胞以及觸發(fā)細胞線粒體重新分布中的作用。方法 體外培養(yǎng)HFF細胞，預(yù)先用1 μg/mL細胞松馳素D(CD)處理30 min，接種弓形蟲速殖子分別培養(yǎng)1 h和20 h，Western blotting檢測弓形蟲表面抗原(surface antigen，SAG)1蛋白表達。同時用MitoTracker?Red CMXRos熒光探針標(biāo)記細胞線粒體，激光共聚焦顯微鏡下觀察HFF細胞線粒體在弓形蟲侵入前后和CD處理前后聚集和分布情況。結(jié)果 感染后1 h，CD處理組HFF細胞內(nèi)蟲體量與CD未處理組差異不大，20 h時CD未處理組細胞內(nèi)蟲體量顯著多于CD處理組。此時可見HFF細胞線粒體明顯聚集成明亮點狀且分布于納蟲泡周圍，而未感染組細胞線粒體未見明顯聚集分布。CD可以顯著抑制弓形蟲侵入HFF細胞后引起的線粒體聚集。結(jié)論 觸發(fā)宿主細胞骨架重塑是弓形蟲侵入宿主細胞并引起細胞線粒體向納蟲泡聚集所必須的。

弓形蟲；細胞骨架重塑；侵入；線粒體重新分布

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81301453), the Laboratory of Parasite and Vector Biology of China, MOPH (No. WSBKTKT201302), the Special Foundation of China Postdoctoral Science (No.2015T80518), the

China Postdoctoral Science Foundation (No.2014M561598), the Jiangsu Postdoctoral Science Foundation (No.1402171C), and the Senior Talent Studying Initial Funding of Jiangsu University (Nos.13JDG023 & 13JDG127) Corresponding authors: Chen Sheng-xia, Email: chensxia@163.com; Cao Jian-ping, Email: caojp@yahoo.com

弓形蟲是一種廣泛流行的專性細胞內(nèi)寄生蟲，可以侵入人體所有的有核細胞(包括吞噬細胞和非吞噬細胞)，并在細胞內(nèi)長期存活。大量研究證實弓形蟲突破非吞噬細胞的細胞膜屏障，侵入細胞過程中伴隨著觸發(fā)宿主細胞骨架重塑(cytoskeleton rearrangement)[1]。細胞骨架是真核細胞中由蛋白纖維構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，包括微絲(microfilament)、微管(microtubule)和中間纖維(intemediate filament)，是構(gòu)成細胞膜以及維持細胞形態(tài)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2]。弓形蟲侵入細胞面臨的第一個障礙就是細胞膜屏障，但目前對于蟲體觸發(fā)宿主骨架重塑與突破細胞膜屏障之間的聯(lián)系并不明晰。

弓形蟲侵入宿主細胞后可以誘導(dǎo)被感染細胞線粒體向蟲體周圍特異性聚集[3]。線粒體是合成能量和脂質(zhì)的重要場所，哺乳動物細胞內(nèi)通常都含有大量線粒體，而弓形蟲速殖子僅有一個線粒體[4]。推測僅有一個線粒體似乎無法滿足蟲體在細胞內(nèi)快速增殖的能量和物質(zhì)需求，誘導(dǎo)宿主線粒體向蟲體周圍靠近，利用宿主細胞線粒體中物質(zhì)與能量就成為弓形蟲的一個必然選擇[3]。雖然現(xiàn)已證實弓形蟲的侵入伴隨著宿主細胞線粒體向蟲體周圍聚集，但對于弓形蟲觸發(fā)宿主細胞線粒體重新分布的機制目前尚不清楚。哺乳動物細胞的細胞骨架相互交錯構(gòu)成骨架網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不僅是細胞器移動的交通導(dǎo)軌，細胞骨架發(fā)生重塑時的收縮或舒張也起到牽引細胞器，幫助其移動的作用，因此線粒體等細胞器重新分布的本質(zhì)是細胞骨架重塑進而牽拉所造成[5]。本研究擬用細胞骨架重塑特異性抑制劑—細胞松弛素D(cytochalasin D, CD)抑制細胞骨架重塑，探討細胞骨架重塑在弓形蟲侵入、增殖和觸發(fā)細胞線粒體重新分布中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體和細胞 弓形蟲RH株速殖子由本課題組長期傳代保種。人包皮成纖維(human foreskin fibroblast, HFF)細胞由本課題組自行原代培養(yǎng)[6]，選取6～20代HFF細胞用于弓形蟲速殖子體外培養(yǎng)及本實驗研究。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM細胞培養(yǎng)液購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。線粒體紅色探針MitoTracker?Red CMXRos購自美國invitrogen公司，兔抗弓形蟲SAG1多克隆抗體由本課題組制備，細胞松弛素D(CD)購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(HRP-IgG)和ECL發(fā)光顯色試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，DAPI染液和抗熒光淬滅封片劑購自南通碧云天生物有限公司，激光共聚焦顯微鏡為德國Leica公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲速殖子體外培養(yǎng) 按本課題組報道方法[7]，在T25細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)HFF細胞，待細胞生長至單層細胞后接種弓形蟲速殖子1×106個，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 h，吸棄舊培養(yǎng)液，以無菌磷酸鹽(PBS)緩沖液充分洗滌細胞，除去未進入細胞的蟲體，添加新培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至蟲體漲破HFF細胞后，以長頸滴管反復(fù)吹打瓶壁收集蟲體。蟲體經(jīng)適當(dāng)稀釋后繼續(xù)接種新HFF細胞或用于后續(xù)研究。

1.2.2 Western blotting檢測SAG1蛋白表達 6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)HFF細胞，待其生長至單層細胞后預(yù)先以1 μg/mL CD處理30 min，接種弓形蟲RH株速殖子，每孔5×105個，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 h后吸棄培養(yǎng)液，以PBS輕柔洗滌細胞2次，除去未粘附或侵入細胞的蟲體。用細胞刮刀刮取生長于細胞培養(yǎng)板內(nèi)細胞，連同蟲體一并以12 000×g離心收集保存于1.5 mL離心管中。另于感染20 h時以同樣方法收集細胞和蟲體。同時設(shè)未加CD對照組，每組3個復(fù)孔。

于收集的蟲體中加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5 min，離心取上清進行SDS-PAGE電泳。分離膠濃度為15%，120 V電泳120 min，直至溴酚藍指示劑達到凝膠底部。恒流150 mA轉(zhuǎn)印50 min將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加抗SAG1多克隆抗體(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。加HRP-羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。吸盡膜上殘留水滴，滴加ECL液顯色并照相記錄。

1.2.3 細胞線粒體分布檢測 預(yù)先在6孔細胞培養(yǎng)板各孔中放置1塊18 mm×18 mm載玻片后培養(yǎng)HFF細胞，待細胞生長至單層細胞后預(yù)先以1 μg/mL CD處理30 min，接種弓形蟲RH株速殖子，每孔5×105個，同時設(shè)未接種蟲體對照組和未加CD對照組。置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 h后吸棄培養(yǎng)液，以PBS輕柔洗滌細胞2次，除去未粘附或侵入細胞的蟲體。各孔中重新添加培養(yǎng)液，并加入終濃度為200 nmol/L線粒體熒光探針，置于37 ℃染色20 min后吸棄染液，以PBS洗滌2次后加入DAPI染液，室溫下避光染色10 min，PBS洗滌2次后滴加抗熒光淬滅封片劑保存于-20 ℃。細胞和蟲體繼續(xù)培養(yǎng)至20 h時，重復(fù)上述操作。染色后標(biāo)本于激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體分布。

2 結(jié) 果

2.1 CD對弓形蟲增殖的影響 接種弓形蟲1 h，CD處理組蟲體數(shù)量與未處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。繼續(xù)培養(yǎng)至20 h時，未處理組蟲體數(shù)量顯著增多(P<0.05)(圖1)。

CD-: un-treaed group; CD+: treated group; *: P<0.05.圖1 弓形蟲在CD處理HFF細胞中增殖能力

Fig.1T.gondiiproliferation in HFF cell treated with cytochalasin D

2.2 弓形蟲侵入觸發(fā)HFF細胞線粒體聚集 在激光共聚焦顯微鏡下可見細胞核與蟲體細胞核呈藍色熒光，HFF細胞線粒體呈紅色熒光。速殖子和HFF細胞的核均不被MitoTracker?Red CMXRos著色。感染組HFF細胞內(nèi)見大量明亮紅色熒光聚集成點狀并圍繞于納蟲泡(parasitophorous vacuole，PV)周圍；而未感染組HFF細胞內(nèi)紅色熒光均勻地分布細胞胞漿中，且少見紅色熒光聚集成點狀(圖 2)。

2.3 CD對弓形蟲觸發(fā)HFF細胞線粒體聚集的影響 HFF細胞預(yù)先以1 μg/mL CD處理30 min后再接種弓形蟲共孵育20 h，在激光共聚焦顯微鏡下未見明顯的細胞內(nèi)紅色熒光聚集成點狀。PV周圍紅色熒光分布均勻，未聚集成點狀。CD未處理組HHF細胞被弓形蟲侵入后，在激光共聚焦顯微鏡下可見細胞內(nèi)大量紅色熒光聚集成點狀，細胞內(nèi)PV周圍可見大量紅色點狀熒光(圖3)。

3 討 論

弓形蟲能夠侵入哺乳動物非吞噬細胞和吞噬細胞[1]。非吞噬細胞不具備主動攝取或吞噬能力，弓形蟲必須具備一套主動侵入機制才能成功進入非吞噬細胞。研究發(fā)現(xiàn)多種細菌都可以通過觸發(fā)宿主細胞骨架重塑，引起細胞膜結(jié)構(gòu)疏松，為細菌侵入細胞創(chuàng)造有利條件[8]。弓形蟲侵入過程中也伴隨一系列與細胞骨架重塑相關(guān)的現(xiàn)象，如線粒體等細胞器重新分布等。但目前尚無研究證實弓形蟲侵入和觸發(fā)細胞線粒體重新分布與宿主細胞骨架重塑有關(guān)。

N: HFF cell nucleus; T:T.gondiinucleus; PV: parasitophorous vacuoles; M: mitochondria

A: DAPI; B: MitoTracker?Red CMXRos

圖2 弓形蟲侵入觸發(fā)HFF細胞線粒體聚集

Fig.2 HFF mitochondria rearrangement triggering byT.gondiiinvasion

N: HFF cell nucleus; T:T.gondiinucleus; PV: parasitophorous vacuoles; M: mitochondria.

A: DAPI; B: MitoTracker?Red CMXRos

圖3 CD抑制弓形蟲觸發(fā)HFF細胞線粒體聚集

Fig.3 HFF mitochondria rearrangement suppressed by CD

細胞松馳素D(CD)常用于病原體侵入與細胞骨架重塑的研究[9]。CD通過特異性破壞細胞骨架重要成份—肌動蛋白，從而抑制細胞骨架重塑，但對細胞內(nèi)其他成份無影響，不會抑制細胞生長，是一種理想的細胞骨架重塑抑制劑。

弓形蟲侵入非吞噬細胞的過程復(fù)雜，可大致分為3個步驟。首先，蟲體主動靠近并緊密地粘附于宿主細胞；其次，調(diào)控宿主細胞膜向內(nèi)凹陷，蟲體通過類錐體端進入細胞；最后，侵入處細胞膜重新封閉形成PV[10]。在PV形成的同時，宿主細胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會特異性向PV靠近[3]，而細胞吞噬體則遠離PV[11]。目前認為，哺乳動物細胞膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變以及細胞器分布位置變化，都是由細胞骨架重塑所引起。

本研究發(fā)現(xiàn)，感染1 h時阻斷細胞骨架重塑并未顯著的減少細胞內(nèi)蟲體數(shù)量，原因是，CD并不影響蟲體粘附于HFF細胞表面，因此通過Western blotting檢測CD處理組與未處理組細胞內(nèi)蟲體數(shù)量差異不明顯。但20 h時，阻斷細胞骨架重塑可以顯著地減少細胞內(nèi)蟲體數(shù)量，其原因在于，CD阻斷宿主細胞骨架重塑雖然不能阻止蟲體粘附于宿主細胞，但可以阻止蟲體侵入細胞，從而影響蟲體在細胞內(nèi)增殖。弓形蟲侵入宿主細胞后觸發(fā)宿主線粒體重新分布并向PV聚集，但線粒體重新分布效應(yīng)被細胞骨架重塑抑制劑CD阻斷。該結(jié)果表明，弓形蟲通過觸發(fā)宿主細胞骨架重塑引起細胞線粒體重新分布，細胞骨架對蟲體侵入和宿主線粒體重新分布具有重要意義。在下一階段研究中，擬尋找弓形蟲觸發(fā)細胞骨架重塑的關(guān)鍵因子，完善弓形蟲侵入機制，為弓形蟲病的治療提供新思路。

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Cytoskeleton rearrangement and mitochondria re-distribution of host cells inToxoplasmagondiiinvasion

WU Liang1,2,WANG Xiao2,SU Dan-hua2,LIU Yuan2,FU Tao2,JIANG Xu-gan2,CHEN Sheng-xia2,CAO Jian-ping1

(1.NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Shanghai200025,China;2.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)

We explored the role of host cell cytoskeleton rearrangement in mitochondria re-distribution duringToxoplasmagondiiinvasion. HFF cells were treated with cytochalasin D (CD) for 30 min, andT,gondiitachzyoites were co-cultured with HFF cells for 1 h and 20 h, respectively. After co-culture, the tachyzoite SAG1 protein was determined by Western blotting. The HFF cell mitochondria were labeled by MitoTracker Red CMXRos fluorescence probe. The HFF cell mitochondria distribution was observed by Confocal microscope inT.gondiiinfected group and CD treated group. After infection for 1 h, the number ofT.gondiitachyzoites had no significant difference between CD treated group and normal group. After infected for 20 h, the number ofT.gondiitachyzoites in normal group was much more than that in CD treated group. After 20 h’s infection, the bright point type of mitochondria gathered beside parasitophorous vacuoles (PVs) in infected group. In normal group, we did not observe the mitochondria aggregation. However, HFF cell mitochondria rearrangement triggered byT.gondiicould be suppressed by cytochalasin D. Triggering of host cell cytoskeleton rearrangement is necessary forT.gondiiproliferation and host cell mitochondria rearrangement to PVs.

Toxoplasmagondii; cytoskeleton rearrangement; invasion; mitochondria rearrangement

國家自然科學(xué)基金(No.81301453)，衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點實驗室開放課題(No.WSBKTKT201302), 中國博士后科學(xué)基金特別資助(No.2015T80518)，中國博士后科學(xué)基金(No.2014M561598)，江蘇省博士后科研計劃(No.1402171C)，江蘇大學(xué)高級人才啟動基金(No.13JDG024，No.13 JDG127)聯(lián)合資助

1.陳盛霞,Email：chensxia@163.com 2.曹建平，Email：caojp@yahoo.com

1.中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，上海 200025; 2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.003

R382

A

1002-2694(2015)11-1001-04

2015-05-20；

2015-08-23