張虞婷，丁蘇蘇，李倚云*

(1.揚(yáng)州市食品藥品檢驗檢測中心，揚(yáng)州 225009； 2.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)，揚(yáng)州 225009)

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細(xì)菌內(nèi)毒素的研究進(jìn)展及其檢查法的應(yīng)用

張虞婷1,2，丁蘇蘇1，李倚云1*

(1.揚(yáng)州市食品藥品檢驗檢測中心，揚(yáng)州 225009； 2.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)，揚(yáng)州 225009)

本文通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，分析和總結(jié)了細(xì)菌內(nèi)毒素的起源、化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性及其毒性反應(yīng)，就其檢查法的應(yīng)用進(jìn)行了三點介紹。細(xì)菌內(nèi)毒素在科學(xué)檢驗與研究中有重要意義，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)菌內(nèi)毒素及其檢查法的研究，將其更好地應(yīng)用于科學(xué)檢驗與研究。

細(xì)菌內(nèi)毒素，鱟試劑，檢查法

近年來，隨著科學(xué)研究的深入，細(xì)菌內(nèi)毒素在科學(xué)檢驗和研究中的應(yīng)用越來越廣泛。為了更好地了解和應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素，本文就細(xì)菌內(nèi)毒素的研究進(jìn)展及其檢查法的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 細(xì)菌內(nèi)毒素的研究進(jìn)展

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外層上的特有成分，廣泛分布于自然界中。通常革蘭陰性菌細(xì)胞壁的外層由脂多糖(LPS)、外膜蛋白質(zhì)、磷脂質(zhì)以及金屬離子所組成。一般細(xì)菌在正常狀態(tài)下不釋放細(xì)菌內(nèi)毒素，只有當(dāng)細(xì)菌死亡、自溶、繁殖或者黏附在其他細(xì)胞時，才表現(xiàn)出毒性[1]。

1.1 細(xì)菌內(nèi)毒素的起源 1890 年，科學(xué)家在研究發(fā)熱物質(zhì)過程中，提出了細(xì)菌內(nèi)毒素的概念。1933年，Boivin 等首次采用三氯醋酸自小鼠傷寒桿菌內(nèi)提取出細(xì)菌內(nèi)毒素，并進(jìn)行免疫學(xué)的研究。因為其蛋白質(zhì)反應(yīng)呈現(xiàn)陰性，所以稱其為脂多糖(LPS)。之后陸續(xù)有學(xué)者采用各種方法從不同的革蘭陰性菌里提取出與 LPS 相似的物質(zhì)，此物質(zhì)有多種毒性反應(yīng)。為了與外毒素區(qū)別，稱之為內(nèi)毒素[2]。1940 年，Morgan 使用志賀氏痢疾桿菌，闡明了細(xì)菌內(nèi)毒素是一種由脂多糖、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)三部分所組成的復(fù)合體[3]。到 20 世紀(jì)中期，隨著免疫學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、物理化學(xué)等各類相關(guān)學(xué)科的進(jìn)步和發(fā)展，細(xì)菌內(nèi)毒素研究工作的深入，特別是其化學(xué)結(jié)構(gòu)組成和各種生物活性間的關(guān)系方面，都更加明確起來。

1.2 細(xì)菌內(nèi)毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu) 細(xì)菌內(nèi)毒素是一種由 LPS、蛋白質(zhì)和磷脂組成的復(fù)合物，分子量約1×106～20×106道爾頓。細(xì)菌內(nèi)毒素與菌體細(xì)胞壁密切相連，其活性成分是 LPS，另外兩個組成成分蛋白質(zhì)和磷脂與其活性無關(guān)。LPS 也是一種結(jié)構(gòu)多樣的大分子復(fù)合物，有抗原性、毒性等特性。其由多糖O抗原、核心多糖和類脂A(Lipid A)三個部分組成。

類脂 A 是 LPS 活性成分中不可缺少的部分，被視為 LPS 的“生物活性中心”，是抗原活性部位，保存著 LPS 的各種生物學(xué)活性。所以 Kasal 等認(rèn)為游離類脂 A 也是一種內(nèi)毒素[2]。類脂 A 位于最外層；多糖抗原向外，其由若干個低聚糖的重復(fù)單位組成的多糖鏈，具有特異性；核心多糖分為內(nèi)核心和外核心；外核心由數(shù)種己糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等組成；內(nèi)核心含有庚糖及特殊的 KDO(3-脫氧-D-甘露醇-辛酮糖)，KDO 以不耐酸的酮糖鍵與類脂 A 的氨基葡萄糖連接，所有革蘭陰性菌都有此結(jié)構(gòu)。類脂 A 是以脂化的葡萄糖氨二糖為單位，通過焦磷酸酯鍵組成的一種獨特的糖脂化合物，具有致熱作用，是革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的活性成分。類脂 A 具有免疫原性，注入動物體內(nèi)可以產(chǎn)生相應(yīng)抗體。類脂 A 的生物學(xué)活性主要在于其以酯鍵相連的脂肪酸，若其被水解，類脂 A 或 LPS 即失去活性[4，5]。

1.3 細(xì)菌內(nèi)毒素的生物活性 類脂 A 作為內(nèi)毒素生物活性的主要部分，也是近年來研究報道最多的。其是由氨基葡萄糖、磷酸及10～18個碳的長鏈脂肪酸組成。類脂A與可溶性的O-特異性鏈及核心分離后，會難溶于水。游離后的類脂 A ，自身可以凝聚成高分子復(fù)合體，復(fù)合體的分子量大小不等。同時，其還含有疏水性的中心及親水性的邊沿。這既是一種雙相分子，又是酸堿兩性分子。所以類脂 A 的獨特結(jié)構(gòu)使細(xì)菌內(nèi)毒素具有多種生物活性[6,7]。

細(xì)菌內(nèi)毒素的生物活性有很多，主要表現(xiàn)在如下幾個方面[8，9]：① 肌體水平：致熱性導(dǎo)致發(fā)熱反應(yīng)[10]、致死性毒性、體質(zhì)量下降、白細(xì)胞和血小板減少、降低血壓導(dǎo)致休克、激活凝血系統(tǒng)使血管內(nèi)凝固、誘導(dǎo)對內(nèi)毒素的耐受性和抗感染的特異性抵抗力。②細(xì)胞水平：活化巨噬細(xì)胞、刺激淋巴細(xì)胞有絲分裂、產(chǎn)生抗前列腺素以及使腫瘤細(xì)胞壞死的作用。③分子水平：活化補(bǔ)體和纖維蛋白溶酶原及鱟細(xì)胞溶解物(鱟試劑)凝集。

1.4 細(xì)菌內(nèi)毒素的毒性反應(yīng) 細(xì)菌內(nèi)毒素由于其特殊的生物活性，會對肌體產(chǎn)生毒性反應(yīng)[11]。

1.4.1 發(fā)熱反應(yīng) 人體對細(xì)菌內(nèi)毒素極為敏感。極微量(1～5 ng/kg)內(nèi)毒素就能引起體溫上升，且發(fā)熱反應(yīng)持續(xù)約 4 h后，才能逐漸消退[12]。人體自然感染時，因為革蘭陰性菌會不斷生長繁殖，而且同時會伴有細(xì)菌陸續(xù)死亡，并釋出內(nèi)毒素，所以發(fā)熱反應(yīng)將持續(xù)至體內(nèi)病原菌完全消滅為止。內(nèi)毒素引起發(fā)熱反應(yīng)的原因是內(nèi)毒素作用于體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，使其產(chǎn)生白細(xì)胞介素1、6和腫瘤壞死因子-α等細(xì)胞因子[13]，這些細(xì)胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，促使體溫升高發(fā)熱。

1.4.2 白細(xì)胞反應(yīng) 細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)入宿主體內(nèi)以后，由于細(xì)胞發(fā)生移動并黏附到組織毛細(xì)血管上，血流中占白細(xì)胞總數(shù)60%～70%的中性粒細(xì)胞數(shù)量迅速減少。但在1～2 h后，由內(nèi)毒素誘生的中性細(xì)胞釋放因子刺激骨髓釋放其中的中性粒細(xì)胞進(jìn)入血流，使其數(shù)量顯著增加，有部分不成熟的中性粒細(xì)胞也被釋放出來[14]。革蘭陰性菌的傷寒沙門菌是例外，其內(nèi)毒素使白細(xì)胞總數(shù)始終是減少狀態(tài)，目前還不清楚是什么原因。由于絕大多數(shù)被革蘭陰性菌感染的患者血流中白細(xì)胞總數(shù)都會增加，所以醫(yī)生在診斷前，為了初步區(qū)別是細(xì)菌性感染還是病毒性感染，常常要檢驗病人的血液，對白細(xì)胞進(jìn)行總數(shù)測定和分類計數(shù)[15]。被病毒感染的病人，其白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比基本在正常值范圍內(nèi)。

1.4.3 內(nèi)毒素休克 當(dāng)病灶或血流中革蘭陰性病原菌大量死亡，釋放出來的大量內(nèi)毒素進(jìn)入血液時，可發(fā)生內(nèi)毒素血癥。大量內(nèi)毒素作用于肌體的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板，以及補(bǔ)體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)等，便會產(chǎn)生白細(xì)胞介素1、6、8和腫瘤壞死因子-α、組胺、5-羥色胺、前列腺素、激肽等生物活性物質(zhì)。這些物質(zhì)作用于小血管造成功能紊亂而導(dǎo)致微循環(huán)障礙，臨床表現(xiàn)為微循環(huán)衰竭、低血壓、缺氧、酸中毒等，于是導(dǎo)致病人休克，這種病理反應(yīng)叫做內(nèi)毒素休克[16]。

在有效的抗菌治療后，由于血中細(xì)菌大量死亡崩解，可加重內(nèi)毒素血癥。因此，在臨床上可能出現(xiàn)感染已控制而以器官損害為特點的病情繼續(xù)惡化的情況，此時需要抗內(nèi)毒素治療。

大量的動物實驗及臨床實踐表明，內(nèi)毒素可造成人及動物多系統(tǒng)的多種疾病，其中包括肺損傷、肝損傷、腸損傷、腎損傷及彌漫性血管內(nèi)凝血、感染性休克、酸中毒及全身多功能臟器衰竭[17]。

2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用

隨著對內(nèi)毒素生物學(xué)功能研究的深入，發(fā)現(xiàn)血循環(huán)中的內(nèi)毒素與肌體多種疾病的發(fā)生有關(guān)，因此內(nèi)毒素檢測在臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)及生命科學(xué)的相關(guān)研究中有非常重要的作用。

現(xiàn)在細(xì)菌內(nèi)毒素最常用的檢查法一般是鱟試劑試驗法， 1964年由美國學(xué)者Levin和Bang發(fā)現(xiàn)微量革蘭陰性菌內(nèi)毒素也可以引起凝膠反應(yīng)，從而在1968年創(chuàng)立了一種定性或定量檢測微量細(xì)菌內(nèi)毒素的體外分析方法(鱟試劑檢測法)[18]。由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)而且操作簡便、快捷，目前在許多領(lǐng)域得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。從此方法建立以來，各國科研人員在細(xì)菌內(nèi)毒素的本質(zhì)和方法學(xué)方面的研究不斷深入和發(fā)展，加之各種新型儀器的開發(fā)，其應(yīng)用已深入到藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)以及臨床檢驗等各個領(lǐng)域。

1980 年，《美國藥典》第20版首先收載鱟試劑法作為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，隨后歐洲、日本藥局等各方也相繼收載了這一方法。1995 年，《中國藥典》 1995 版二部附錄收載了修訂后的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[15]。2003 年，對細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測開始在我國臨床全面開展應(yīng)用?，F(xiàn)在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法作為替代注射劑熱原檢查的一種新試驗方法，不僅在試驗方法上越來越統(tǒng)一和協(xié)調(diào)，而且在檢驗品種數(shù)量上也是逐年遞增。由此可見，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(鱟試劑法)替代熱原檢查是一種趨勢。隨著研究的不斷深入，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用也越來越廣泛。

2.1 在臨床的應(yīng)用 體液內(nèi)毒素水平是監(jiān)測和診斷嚴(yán)重細(xì)菌性炎癥反應(yīng)(尤其是革蘭陰性菌)的一個重要特異性指標(biāo)[19]。內(nèi)毒素水平的檢測在臨床上主要有如下幾種應(yīng)用[20]：① 監(jiān)控具有感染危險的患者，尤其在對于ICU病區(qū)感染性疾病患者的治療中，及早進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，有助于臨床的及早診斷和治療，有很高的臨床意義[21]；② 細(xì)菌性炎性疾病的鑒別診斷[22]；③ 監(jiān)控病程和防御膿毒血癥；④ 原因不明的發(fā)熱和敗血癥預(yù)測性指標(biāo)[23]； ⑤ 血液透析液的檢測：血液透析液是尿毒癥患者得以生存的基礎(chǔ)，所以為了保證血液透析液的質(zhì)量，檢查其中的內(nèi)毒素對于保證臨床上的治療效果和患者的安全有著至關(guān)重要的作用[24，25]；⑥ 其他：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查還可用于飲用水檢測[26]、醫(yī)用的明膠檢測[27]、臨床使用的水膠體敷料檢測[28]。

2.2 藥品中的應(yīng)用 主要是注射劑，也有少量固體制劑，涉及的種類包括中藥、化學(xué)藥、藥物中間體、藥用輔料等[29-35]。用細(xì)菌內(nèi)毒檢查法代替熱原法也符合動物福利的3R原則，所以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法今后的應(yīng)用會越來越多。

2.3 醫(yī)療器械中的應(yīng)用 主要是指輸液器、注射器以及輸血器、醫(yī)用制品等。一般常用的試驗液主要是用注射用水或生理鹽水來進(jìn)行調(diào)制，但各國標(biāo)準(zhǔn)差異較大，所以對試驗液的調(diào)制條件要求也各異，一般浸提時間、浸提溫度對醫(yī)療器械的細(xì)菌內(nèi)毒素的影響較大[36，37]，在實際檢測中要特別注意。

2.4 血液中細(xì)菌內(nèi)毒素的測定 主要是用于肌體血液中的細(xì)菌內(nèi)毒素監(jiān)測，為臨床診斷提供實驗數(shù)據(jù)。但由于血液中含有許多干擾鱟試劑試驗反應(yīng)的物質(zhì)(如各種蛋白酶抑制劑、內(nèi)毒素結(jié)合蛋白等)[38]，因此，對這些干擾物質(zhì)的除去即血液的前處理工作是極為重要的。

3 小結(jié)

細(xì)菌內(nèi)毒素與人們健康生活的很多方面密切相關(guān)，檢測各種樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素，對于藥品、醫(yī)療器械的安全以及臨床上相關(guān)疾病的早期診斷具有重要的意義。隨著免疫學(xué)、生物學(xué)等各個學(xué)科的不斷深入研究和發(fā)展，細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查法也越來越先進(jìn)，但鱟試劑法中的鱟是一種珍稀動物，保護(hù)鱟資源也是義不容辭的責(zé)任，所以在細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查替代法方面也要不斷作出努力，同時要在具體實驗中不斷探索，不斷完善實驗方法，真正做到經(jīng)濟(jì)和高效，人與自然的和諧。

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2015-03-17

R927.1

A

1006-5687(2015)05-0066-04

*通訊作者：李倚云，E-mail：343559262@qq.com。