代亮，張志東，田垚，蔣寧，牛遠(yuǎn)杰

類器官在前列腺癌相關(guān)研究中的作用探索

代亮，張志東，田垚，蔣寧，牛遠(yuǎn)杰△

類器官作為新一代臨床前腫瘤模型，其建立對(duì)于揭示腫瘤生物學(xué)特性及探索對(duì)腫瘤患者有效的治療方法具有重要意義。前列腺來(lái)源的類器官臨床前腫瘤模型更是在前列腺腫瘤生物學(xué)特性研究和抗腫瘤藥物篩選中發(fā)揮了巨大作用。當(dāng)前普遍且成熟用于構(gòu)建臨床前前列腺腫瘤模型的方式有2種：一種是前列腺腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)，另一種是人源性前列腺腫瘤組織異種移植。這2種模型在前列腺癌基礎(chǔ)研究與抗前列腺腫瘤藥物篩選方面具有很高價(jià)值，但仍存在諸多無(wú)法回避的問(wèn)題與劣勢(shì)。最新研究構(gòu)建的第三類臨床前腫瘤模型——類器官或可解決當(dāng)前2種模型所存在的弊端。本文就類器官在前列腺癌相關(guān)研究中作用的研究進(jìn)展作一綜述。

類器官；前列腺腫瘤；異種移植模型抗腫瘤試驗(yàn)；綜述；臨床前腫瘤模型；前列腺腫瘤細(xì)胞系

前列腺癌是當(dāng)前男性死亡率第二的腫瘤，據(jù)報(bào)道，2013年美國(guó)因前列腺癌而死亡的男性達(dá)29 720例［1］。對(duì)于早期前列腺癌患者，通常采取手術(shù)和放療相結(jié)合的方法。晚期前列腺癌以抗雄激素治療為標(biāo)準(zhǔn)手段，但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的治療后，大部分患者最終仍會(huì)發(fā)展成為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）［2］。為探索前列腺癌的生物學(xué)特性及提高其診治水平，學(xué)者們通常運(yùn)用臨床前前列腺腫瘤模型來(lái)模擬前列腺癌在人體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展情況，并對(duì)體內(nèi)藥物反應(yīng)進(jìn)行研究。當(dāng)前普遍運(yùn)用的為前列腺腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)與人源性前列腺腫瘤組織異種移植2種方式。由于人體內(nèi)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制精確復(fù)雜、生長(zhǎng)環(huán)境因素繁多，致使這2種模型的模仿效果與精準(zhǔn)度均不理想。因此，許多在模型中作用明顯的備選藥物并未能應(yīng)用于臨床，不僅浪費(fèi)了大量研究資源，而且使患者不能得到最佳的治療［3］。本文旨在探討類器官在前列腺癌相關(guān)研究中的作用。

1 前列腺腫瘤細(xì)胞系

前列腺腫瘤細(xì)胞系是一種重要的前列腺癌研究模型。1977年來(lái)源于前列腺癌腦轉(zhuǎn)移灶所構(gòu)建的DU145細(xì)胞株為首支前列腺腫瘤細(xì)胞系。當(dāng)前最常用的前列腺腫瘤細(xì)胞系有7種，分別為：DU145、LNCAP、PC3、C42、22RV1、VCap及MDA-PCA，其在研究方面具有同源、易復(fù)制、單一培養(yǎng)，幾乎可無(wú)限增殖及可應(yīng)用于包括高通量藥物篩選在內(nèi)的大量實(shí)驗(yàn)等優(yōu)勢(shì)［4］。阻礙前列腺腫瘤細(xì)胞系更廣泛地應(yīng)用于前列腺癌研究是其構(gòu)建成功率很低，目前成功構(gòu)建的前列腺腫瘤細(xì)胞株不足10種，因此無(wú)法代表龐大的臨床疾病譜［5］。加之建立的腫瘤細(xì)胞系大多來(lái)源于腫瘤的轉(zhuǎn)移灶或進(jìn)展較快的腫瘤，因此原發(fā)性或進(jìn)展緩慢的腫瘤無(wú)法得以科學(xué)準(zhǔn)確地認(rèn)識(shí)與研究［6］。體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞往往使得腫瘤的異質(zhì)性和適應(yīng)性缺失，使其基因表達(dá)更接近于正常組織而非腫瘤組織。另外，有研究認(rèn)為傳統(tǒng)的2D細(xì)胞系培養(yǎng)模式無(wú)法模擬細(xì)胞與周?chē)M織微環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用［7］。為解決腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境問(wèn)題，有研究將人類腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，篩選出穩(wěn)定的細(xì)胞株并注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，用以模仿人體內(nèi)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，但因腫瘤細(xì)胞株在體外培養(yǎng)傳代若干次，使得其只是適應(yīng)外界培養(yǎng)皿的條件，而注入小鼠體內(nèi)后，腫瘤則表現(xiàn)出與小鼠的同質(zhì)性，丟失了原代腫瘤的特性，不能客觀準(zhǔn)確反映腫瘤的真實(shí)發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，研究效果并不讓人滿意［8］。

2 人源性腫瘤組織異種移植

人源性腫瘤組織異種移植（patient derived tumor xeno?grafts，PDTX）是通過(guò)將切下的新鮮腫瘤組織直接種植于免疫缺陷鼠的皮下、原位或腎被膜下而構(gòu)成。隨著PDTX的增長(zhǎng)，可以將其連續(xù)植入多個(gè)動(dòng)物體內(nèi)。同時(shí)，PDTX保持了原代腫瘤和周?chē)|(zhì)結(jié)構(gòu)，能更加準(zhǔn)確地反映出腫瘤細(xì)胞與周?chē)h(huán)境的相互作用。研究認(rèn)為，PDTX的構(gòu)建成功率較腫瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)成功率要高得多，且不易發(fā)生基因突變［9］。現(xiàn)已有多種生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的原發(fā)性腫瘤PDTX構(gòu)建成功，并證實(shí)為較有效的臨床前模型。雖然PDTX已經(jīng)解決了腫瘤細(xì)胞系所不能滿足的諸多研究需求問(wèn)題，但其仍有一些不足：（1）建立連續(xù)傳代的PDTX成功率很低，且對(duì)于人源性腫瘤組織有很高的要求［10］。（2）PDTX與親代腫瘤是否具有相似性必須經(jīng)過(guò)復(fù)雜嚴(yán)格的測(cè)定［11］。（3）人源腫瘤和移植受體之間的配體受體關(guān)系并不完全吻合，如HGF-MET［12］。（4）應(yīng)用動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，針對(duì)相應(yīng)信號(hào)通路的研究設(shè)想及藥物篩選并不能完全適用于臨床。利用原代腫瘤建立的前列腺類器官體外培養(yǎng)模型可成功結(jié)合前列腺腫瘤細(xì)胞系和PDTX的優(yōu)點(diǎn)，為前列腺癌的研究提供了新的工具。

3 前列腺類器官

類器官（organoid）是將具有干性潛能的細(xì)胞包被于人工基底膜（matrigel）中進(jìn)行3D培養(yǎng)，從而形成相應(yīng)器官來(lái)源的上皮結(jié)構(gòu)。作為2013年《科學(xué)》十大發(fā)現(xiàn)之一的類器官能準(zhǔn)確模擬體內(nèi)上皮結(jié)構(gòu)并能長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)［13］。目前已經(jīng)成功建立了鼠小腸［14］、胃［15］、肝臟［16］、胰腺［17］、結(jié)腸［18］、前列腺［19-20］類器官，人小腸、結(jié)腸［18］、大腦［21］、肝臟［22］、腎臟［23］、前列腺［19-20］的類器官。這些類器官均能進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，且具有穩(wěn)定的表型和遺傳學(xué)特征。

前列腺類器官作為一種新型且能夠在體外進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)的前列腺癌研究模型，呈球形囊狀微結(jié)構(gòu)，并與體內(nèi)前列腺腺泡結(jié)構(gòu)相似，包含分化的基底（basal）和管腔（luminal）細(xì)胞層［24］。目前已經(jīng)建立的前列腺類器官模型包括鼠前列腺組織、單個(gè)的luminal和basal細(xì)胞、人正常前列腺組織［19］、前列腺癌患者轉(zhuǎn)移灶病理標(biāo)本以及CRPC患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞來(lái)源的類器官［20］，且能連續(xù)培養(yǎng)1年以上穩(wěn)定傳代并保持穩(wěn)定的表型［19-20］。

3.1 前列腺類器官模擬體內(nèi)前列腺組織前列腺類器官?gòu)V泛的應(yīng)用前景在于其能在體外準(zhǔn)確模擬體內(nèi)前列腺組織。通過(guò)HE染色可見(jiàn)前列腺類器官表現(xiàn)為類似于體內(nèi)前列腺的腺腔結(jié)構(gòu)；免疫組化分析可見(jiàn)前列腺腺體典型的腺泡樣結(jié)構(gòu)，basal層（外層）能特異性表達(dá)前列腺basal標(biāo)志物——CK5和p63，luminal層（內(nèi)層）則特異性表達(dá)luminal標(biāo)志物——CK8，且與體內(nèi)前列腺腺腔結(jié)構(gòu)相吻合［19］。

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)的前列腺類器官遺傳學(xué)穩(wěn)定性良好，通過(guò)基因測(cè)序轉(zhuǎn)移灶樣本和相關(guān)來(lái)源類器官顯示，每個(gè)類器官與其來(lái)源的患者基因完全一致［20］。CRPC患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞來(lái)源的7種類器官細(xì)胞系表現(xiàn)出了前列腺癌相關(guān)的遺傳學(xué)改變，包括TMPRSS2–ERG染色體融合，DNA修復(fù)與染色體調(diào)節(jié)通路突變；SPOP、FOXA1、PIK3R1突變，SPINK1過(guò)表達(dá)，CHD1、PTEN、p53基因缺失，RB腫瘤抑制通路缺失等［20］。在功能上，正常的前列腺類器官表現(xiàn)出正常的雄激素受體（AR）水平且具有完整的AR信號(hào)通路［19］。不同來(lái)源的前列腺癌組織培養(yǎng)出的類器官能表現(xiàn)出其相對(duì)的AR活性，并在藥物作用下表現(xiàn)出相應(yīng)變化［20］。

3.2 前列腺類器官的培養(yǎng)條件及探索前列腺類器官成功培養(yǎng)的關(guān)鍵是：在無(wú)基質(zhì)條件下，用人工培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外3D培養(yǎng)。Sato等［14］通過(guò)模擬小腸干細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境成功培養(yǎng)出了小腸類器官，并摸索建立了類器官培養(yǎng)的通用培養(yǎng)基（ENR），包括：細(xì)胞分裂素（EGF），Noggin（抑制BMP信號(hào)通路），R-spondin-1（促進(jìn)Wnt信號(hào)通路），Matrigel（基底膜代替物）。鼠前列腺的培養(yǎng)以ENR為基礎(chǔ)，需要添加額外生長(zhǎng)因子，包括DHT和Alk3/4/5抑制劑A83-01，其中A83-01通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β信號(hào)通路來(lái)抑制前列腺細(xì)胞的增殖［25-26］。Noggin與R-spondin-1能提高類器官培養(yǎng)形成率，同時(shí)加快其生長(zhǎng)速度，DHT則可以顯著提高類器官的形成率，而EGF對(duì)于類器官的建立和傳代都是必需的［19］。

人前列腺類器官的培養(yǎng)在此基礎(chǔ)上（ENR+A83-01+ DHT）需要添加額外的生長(zhǎng)因子：纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）-10、FGF-2、前列腺素E2（PGE2）、煙堿及p38激酶抑制劑SB202190。其中EGF、FGF-2、煙堿、PGE2及A83-01可促進(jìn)類器官的生長(zhǎng)，而移除SB202190會(huì)出現(xiàn)類器官組織角質(zhì)化，移除FGF-10、Noggin或R-spondin-1后類器官形成率顯著降低，但傳代不受影響，且上述任何一種生長(zhǎng)因子的缺失都會(huì)降低AR的表達(dá)水平，特別是移除R-spondin-1或Noggin后AR表達(dá)徹底喪失，移除EGF后AR的mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)及AR靶基因PSA會(huì)輕度上調(diào)［19-20］。

3.3 前列腺類器官應(yīng)用及展望

3.3.1 前列腺上皮細(xì)胞干性研究前列腺上皮細(xì)胞中干祖細(xì)胞一直是前列腺癌研究的熱點(diǎn)之一。經(jīng)典的去勢(shì)與體外雄激素替代實(shí)驗(yàn)表明，前列腺上皮中存在具有再生能力的前列腺干祖細(xì)胞，這些細(xì)胞可能在前列腺癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究其特征對(duì)于了解前列腺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義［27］。

前列腺導(dǎo)管上皮主要由basal細(xì)胞、luminal細(xì)胞和少量神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞3種細(xì)胞構(gòu)成［28］。究竟哪種細(xì)胞具有干性及3種細(xì)胞的分化機(jī)制尚不明確。傳統(tǒng)胚胎尿生殖竇間質(zhì)（UGSM）組織重組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，basal細(xì)胞具有雙重潛能［29］。近幾年利用轉(zhuǎn)基因鼠通過(guò)譜系追蹤發(fā)現(xiàn)，前列腺Ck5+basal和Ck8+luminal都具有干細(xì)胞活性［30-31］。Wang等［32］研究顯示，在前列腺中存在少量多種潛能的basal細(xì)胞。另有研究顯示，鼠castration-resistant Nkx3.1+luminal cell（CARN）亦具有多種潛能［33］。

作為研究前列腺上皮細(xì)胞干性的一種新的研究模型，前列腺類器官則通過(guò)流式分選挑出單個(gè)basal和luminal細(xì)胞，分別體外培養(yǎng)形成具有類前列腺腺腔結(jié)構(gòu)的類器官，免疫組化及免疫熒光等實(shí)驗(yàn)表明，basal和luminal細(xì)胞中均存在多種潛能祖細(xì)胞［19］。前列腺類器官模型和譜系追蹤技術(shù)相結(jié)合進(jìn)一步證實(shí)了castration-resistant Nkx3.1+luminal cell（CARN）具有多種潛能［34］。

3.3.2 研究前列腺腫瘤基因組學(xué)及生物學(xué)的重要工具隨著大規(guī)模基因組學(xué)研究的開(kāi)展，大量前列腺癌相關(guān)的基因改變逐漸成為前列腺癌研究的熱點(diǎn)［35-36］。轉(zhuǎn)基因工程鼠模型作為研究前列腺腫瘤基因組學(xué)和生物學(xué)的重要工具，因耗時(shí)和價(jià)格昂貴，其應(yīng)用受到了很大限制。前列腺類器官體外研究模型的成功建立為前列腺癌的相關(guān)研究提供了新的可行工具。

研究表明，常用的前列腺癌轉(zhuǎn)基因工程鼠來(lái)源的類器官模型在組織學(xué)上與轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)表現(xiàn)完全吻合，如PbCre PtenloxP/loxP（敲除Pten基因）前列腺類器官在組織學(xué)上表現(xiàn)為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；PbCre Rosa26LSL-ERG（過(guò)表達(dá)ERG）前列腺類器官在組織學(xué)上則表現(xiàn)為正常管腔結(jié)構(gòu)；PbCre PtenloxP/loxPRosa26LSL-ERG（同時(shí)敲除Pten基因和過(guò)表達(dá)ERG）前列腺類器官則可見(jiàn)許多指狀突觸伸入matrigel，提示其具有侵襲性，均良好吻合了之前的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［37］。上述研究表明，體外培養(yǎng)的前列腺類器官在表型上的確能夠模擬體內(nèi)情況。同時(shí)，前列腺類器官能夠在體外進(jìn)行慢病毒［19］與CRISPR/Cas9系統(tǒng)［38］的基因編輯，從而在研究前列腺癌相關(guān)基因方面發(fā)揮巨大作用。由此可見(jiàn)，前列腺類器官體外研究模型既具有轉(zhuǎn)基因工程鼠的組織學(xué)表型，又具備體外細(xì)胞系能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)的特性，且具有能夠體外進(jìn)行基因編輯的特點(diǎn)，因此必將成為研究前列腺腫瘤基因組學(xué)及生物學(xué)的重要工具。

3.3.3 前列腺癌藥理學(xué)研究的重要工具抗雄激素藥物恩雜魯胺和雄激素合成抑制劑——醋酸阿比特龍為新一代前列腺癌治療藥物，已經(jīng)成為治療晚期前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療手段［39］，而且2種藥物都能顯著延長(zhǎng)前列腺癌患者生存期［40-41］。然而他們的治療效果非常不穩(wěn)定，僅有30%的患者治療效果可持續(xù)6個(gè)月以上［42］。因此亟需新的研究手段用于藥物的研發(fā)與篩選。目前廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)的體外細(xì)胞系2D培養(yǎng)系統(tǒng)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性好，但現(xiàn)僅有的前列腺癌細(xì)胞系無(wú)法代表龐大的臨床疾病譜，而且細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)受到基質(zhì)和支持組織等周?chē)h(huán)境的影響［43］。這種單一的培養(yǎng)模式與體內(nèi)的真實(shí)環(huán)境相差甚遠(yuǎn)，成為高通量藥物篩選的主要障礙。其他的體外研究模型包括PDTX和基因工程鼠模型，由于價(jià)格昂貴、費(fèi)時(shí)、無(wú)法快速有效地進(jìn)行大規(guī)模藥物篩選以及鼠的個(gè)體差異均會(huì)影響藥物干預(yù)的結(jié)果分析等，因此無(wú)法大規(guī)模推廣［44］。

Gao等［20］體外建立了7種晚期前列腺癌患者來(lái)源的類器官，觀察其對(duì)抗恩雜魯胺和醋酸阿比特龍的敏感度，證實(shí)其治療效果與體內(nèi)試驗(yàn)完全吻合；其中一株類器官來(lái)源于晚期前列腺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs），因此有望僅憑患者少量血液，而無(wú)需經(jīng)過(guò)復(fù)雜且有創(chuàng)的組織活檢即可建立患者特異性的類器官模型。近年來(lái)CTCs常被用于乳腺癌的藥物篩選，表明CTCs在高級(jí)實(shí)體腫瘤診斷中的可行性和巨大應(yīng)用前景［45］。同時(shí)Dekkers等［46］利用類器官建立了用于研究不同個(gè)體藥代動(dòng)力學(xué)差異的藥理學(xué)研究模型。因此，直接采集前列腺癌患者血液中的CTCs用于體外培養(yǎng)類器官，依托其遺傳學(xué)穩(wěn)定的特點(diǎn)，建立不同患者的腫瘤細(xì)胞類器官庫(kù)，從而對(duì)不同患者可進(jìn)行高通量體外藥物篩選。通過(guò)體外藥物篩選，既能發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點(diǎn)，又能針對(duì)不同個(gè)體的遺傳學(xué)改變選擇特異的靶向治療藥物，并利用類器官藥理學(xué)研究模型檢測(cè)患者藥代動(dòng)力學(xué)特征，合理安排藥物劑量，從而實(shí)現(xiàn)個(gè)體化醫(yī)療。最終目標(biāo)是針對(duì)不同個(gè)體進(jìn)行特異性治療，從而大大改善前列腺癌患者的預(yù)后，提高生存率。

此外，前列腺類器官在基因治療方面也表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。雖然當(dāng)前關(guān)于前列腺癌類器官干細(xì)胞治療尚少見(jiàn)報(bào)道，但Schwank等［38］利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，將修復(fù)片段整合入囊性纖維化患者來(lái)源的類器官，糾正了類器官的突變表型。Yui等［47］將體外培養(yǎng)的干細(xì)胞來(lái)源的結(jié)腸上皮類器官移植入損傷的小鼠結(jié)腸上皮，并成功修復(fù)了損傷的結(jié)腸上皮。這些研究成果展現(xiàn)出了類器官用于基因治療的巨大潛力，引發(fā)了將前列腺癌類器官通過(guò)體外基因修復(fù)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)組織學(xué)修復(fù)的思考。

綜上所述，類器官作為一種新型的前列腺腫瘤體外研究模型，既能準(zhǔn)確模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)及生理學(xué)過(guò)程，又能連續(xù)傳代并進(jìn)行基因修飾。雖然當(dāng)前類器官培養(yǎng)技術(shù)相對(duì)困難，但相信在不久的將來(lái)定能成為前列腺腫瘤機(jī)制研究、藥物研發(fā)及臨床指導(dǎo)不可或缺的工具。

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（2015-02-13收稿2015-03-17修回）

（本文編輯陸榮展）

Role of organoid in prostate cancer research

DAI Liang，ZHANG Zhidong，TIAN Yao，JIANG Ning，NIU Yuanjie△
Tianjin Institute of Urology；Tianjin Key Laboratory of Urology；The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China△

As a new model of pre-cancer，organoid is essential for the basic understanding of tumor characteristic and effective tumor treatment.Organoids derived from prostate play an especially important role in the research of fundamental oncology and anticancer drug screen against prostate cancer.Prostate cancer cell lines and xenografts derived directly from primary human tumors are widely used now as models to study prostate cancer and have proven very valuable.But there are some caveats and shortcomes of these two models that have to be accounted for.Here we outline organoid as a third preclini?cal cancer model which may potentially overcome the shortcomes of cancer cell lines and PDTX.This article aims to summa?rizee recent progress of the role of organoid in prostate cancer research.

organoid；prostatic neoplasms；X enograft model antitumor assays；review；reclinical model；prostate can?cer cell lines

R318.16

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.032

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院；天津市泌尿外科基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；天津市泌尿外科研究所（郵編300211）

代亮（1990），男，碩士在讀，主要從事前列腺癌相關(guān)方面研究

△通訊作者E-mail：niuyuanjie9317@sina.com