鄔亭亭 劉平 郭述良 羅永艾

（1.成都市第三人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，四川 成都 610031；2.重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，重慶 401220；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400016）

噬菌體是一種可以裂解細(xì)菌的病毒，利用這一特性可以將其應(yīng)用于抗菌治療。在抗生素發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用之前，研究人員已經(jīng)開始嘗試應(yīng)用噬菌體防治細(xì)菌感染，并取得了大量成果。最近，由于各種耐藥性病原菌的出現(xiàn)，以及新型抗生素研發(fā)越來越困難，噬菌體治療細(xì)菌感染重新得到人們的重視。目前全球結(jié)核病耐藥形勢嚴(yán)峻，耐多藥結(jié)核病和泛耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)使患者陷入無藥可治的境地。噬菌體治療其它耐藥菌屬獲得成功［1］的報道提示，可以裂解結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的分枝桿菌噬菌體具有治療結(jié)核病的潛在價值。20世紀(jì)70年代研究者就利用分枝桿菌噬菌體33D 能夠裂MTB的特點(diǎn)對分枝桿菌進(jìn)行分型［2］。本文通過研究噬菌體33D 基本生物學(xué)特征以及與宿主菌之間的作用規(guī)律，篩選能裂解耐藥MTB的寬噬噬菌體，為分枝桿菌噬菌體雞尾酒療法抗耐藥結(jié)核研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 噬菌體及其宿主菌 噬菌體33D、Legendre、Leo、DNAⅢ、BO4、Sedeg、Clark由加拿大拉瓦爾大學(xué)Félix d＇Hérelle噬菌體中心提供，噬菌體TM4由美國匹茲堡大學(xué)Hatfull教授贈送，噬菌體D29和恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，MS）mc2155 均由中國食品藥品檢定研究院王國治教授惠贈，MTB H37Rv由重慶市肺科醫(yī)院提供，其余分枝桿菌臨床株自行從重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院結(jié)核病人痰中分離（2010年5月－2011年4月），比例法檢測藥敏。所有與分枝桿菌相關(guān)的實(shí)驗(yàn)均在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生物安全二級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭大耳白兔，雄性，2.0～2.5 kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，符合倫理要求。

1.3 主要試劑 7H9培養(yǎng)基（美國BD 公司），7H10培養(yǎng)基（美國BD 公司），羅氏培養(yǎng)基（珠海貝索公司），OADC增菌液（美國sigma公司），福氏完全佐劑（美國sigma公司）。

1.4 噬菌體的培養(yǎng)與噬菌斑觀察 采用雙層瓊脂平板培養(yǎng)法。參照文獻(xiàn)［3］的方法，37℃過夜培養(yǎng)，次日即可見長出大量噬斑。

1.5 噬菌體的電鏡觀察 參照文獻(xiàn)［4］中λ噬菌體顆粒提取方法，略加改動，提取噬菌體33D 顆粒。取純化的33D 顆粒20μl滴于銅網(wǎng)上，待其自然沉淀15 min，用濾紙從側(cè)面吸走多余液體，加1滴20g／L磷鎢酸（pH7.0）于銅網(wǎng)上，染色10 min，用濾紙從側(cè)面吸去染液，干燥后用電鏡觀察20個視野以上。

1.6 最佳感染復(fù)數(shù)的測定 參照Lu等的方法［5］，每個感染復(fù)數(shù)（muitiplicity of infection，MOI）值做雙份復(fù)管取平均值，同時以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以產(chǎn)生最高噬菌體滴度的MOI為33D 最佳MOI，以噬菌體感染MS 24h后全部宿主菌被裂解的最小MOI為33D 最低MOI。

1.7 一步生長曲線的繪制 參照Lu和weiss等的方法［5，6］，略有改動。加入噬菌體33D 及宿主菌MS使MOI＝0.1，37℃溫育15min后13 000g離心1min，棄上清，7H9液洗滌2次，稀釋104倍，用5ml預(yù)熱的7H9液混懸沉淀并充分混勻，迅速置于37℃大振幅搖床中培養(yǎng)（160r／min），開始計(jì)時，于0時刻和每隔15 min取樣50μl，13 000g離心1min，吸取上清測定噬菌體滴度，各時間點(diǎn)均作雙份復(fù)管取平均值，同時以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。最后以感染時間為橫坐標(biāo)，感染體系中噬菌體的滴度為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線，得出33D 的潛伏期、爆發(fā)期和爆發(fā)量。

1.8 噬菌體理化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.8.1 噬菌體的熱穩(wěn)定性測定實(shí)驗(yàn) 將33D 原液稀釋至1010pfu／ml，分別于37℃、60℃、70℃保溫1h，每隔15min取樣，樣品立即置入冰浴中冷卻，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，測定噬菌體效價。

1.8.2 噬菌體紫外線穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將8 ml噬菌體33D 稀釋液加至直徑7.0cm 的平皿中，暴露于生物安全柜中紫外燈（30w，40cm）下進(jìn)行照射，在不同處理時間分別取樣，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，測定噬菌體效價，并計(jì)算噬菌體的存活率。

1.8.3 噬菌體75%酒精穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將10μl噬菌體33D 原液加入990μl 75%酒精中，在不同的時間分別取樣，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，測定噬菌體效價，并計(jì)算噬菌體的存活率。

1.8.4 噬菌體的pH 穩(wěn)定性測定實(shí)驗(yàn) 略有改變。分別取不同pH 值的7H9液4.5ml加入到內(nèi)徑為12 mm 試管中，置于25℃的恒溫水浴中，待溫度平衡后加入0.5ml的33D 原液，恒溫保存1h后，經(jīng)適當(dāng)稀釋，測定噬菌體效價［7］。噬菌體裂解能力的pH 值穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將D29原液按一定比例稀釋，吸取10μl稀釋液加入到0.2ml對數(shù)生長期的宿主菌MS中，混勻，室溫放置15min。分別用pH 為5和7.4的雙層瓊脂平板培養(yǎng)法培養(yǎng)。次日觀察不同pH 值的培養(yǎng)板形成噬菌斑的情況。

1.8.5 噬菌體氯仿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將噬菌體D29（滴度：1×109pfu／ml）與等體積氯仿混勻，作用20min后10 000g離心10min，收集上層水相，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，測定噬菌體效價。

1.9 噬菌體寬噬實(shí)驗(yàn) 分別以各分枝桿菌臨床分離株為宿主菌，用噬菌體33D 進(jìn)行雙層平板噬菌斑實(shí)驗(yàn)。將稀釋的各宿主菌在雙層培養(yǎng)基上分別制成均勻的菌苔。將33D 樣液（滴度：1×109pfu／ml）20μl滴加到菌苔上，待液滴干燥后倒置于37℃孵育，6wk后觀察結(jié)果［3］。

1.10 抗噬菌體血清制備及中和和交叉中和試驗(yàn)1.10.1 33D 抗血清制備 將純化的33D 噬菌體過濾除菌后加福氏佐劑皮下注射免疫純種新西蘭兔，制備抗血清。每周免疫注射兩次，分別于免疫6－8wk后試血。試血以1∶100稀釋的抗噬菌體血清能在5min內(nèi)中和90%以上的噬菌體時，即可心臟采血。

1.1 0.2 血清中和實(shí)驗(yàn) 按方法［8］進(jìn)行血清中和試驗(yàn)并利用公式測定抗噬菌體血清K 值。

式中P0為未加抗血清時測定的噬菌體滴度，P 為經(jīng)t分鐘后測定的噬菌體滴度，本實(shí)驗(yàn)中t＝5，D 是抗血清稀釋度。

1.1 0.3 血清交叉中和實(shí)驗(yàn) 以噬菌體33D 的抗血清分別與D29、Legendre、Leo、DNAⅢ、TM4、BO4、Sedeg、Clark噬菌體進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，方法同上測定它們的交叉中和反應(yīng)速率K。

1.11 噬菌體核酸提取與鑒定 噬菌體33D 核酸提取使用λ噬菌體基因組DNA 快速提取試劑盒（北京艾比根生物技術(shù)有限公司，中國）。33D DNA 溶解定量后用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅢ和EcoRⅠ酶切33D 基因組核酸。根據(jù)酶切圖譜鑒定其核酸類型。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體33D 噬菌斑及噬菌體顆粒形態(tài)分析

2.1.1 噬菌斑形態(tài)分析 噬菌體33D 感染MS所形成的噬菌斑形態(tài)（圖1－A）：噬菌斑形態(tài)穩(wěn)定、均一，直徑約為2 mm，圓形透明，邊緣清晰，呈現(xiàn)出典型的裂解性噬菌體的噬斑特征。

2.1.2 噬菌體顆粒形態(tài)學(xué)分析 噬菌體33D 粒子經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1－B）：噬菌體33D有一個長多面體立體對稱的頭部，頭長徑（L）約65nm，頭橫徑（W）約55nm，L／W ＝1.18，尾長約201nm。

圖1 噬菌體33D感染MS所形成的噬菌斑形態(tài)（A）及33D 粒子電鏡照片（B）Fig.1 Plaques produced by phage 33Dinfecting MS（A）and electron micrograph of 33D（B）

2.2 噬菌體33D 最佳MOI的測定 噬菌體33D 和宿主菌MS培養(yǎng)24h后，加入噬菌體緩沖液2 ml于37℃培養(yǎng)箱孵育1h，收集各平皿上清分別測定噬菌體滴度，結(jié)果見表1?？梢妼τ?3D M0I為0.000 01時，產(chǎn)生子代噬菌體數(shù)量最多，因此噬菌體33D 感染其宿主菌MS 的最佳MOI數(shù)為0.000 01；噬菌體和宿主菌培養(yǎng)24h后，噬菌體33D 的M0I分別為l0、1、0.1、0.01和0.001時，培養(yǎng)板均呈完全透明，所有宿主菌被裂解完全，因此噬菌體33D 感染其宿主菌MS最低MOI為0.001。

表1 噬菌體33D最佳感染復(fù)數(shù)的測定Table 1 Determination of optional multiplicity of infection

2.3 噬菌體33D 一步生長曲線 從曲線可以清晰地看出33D 感染宿主菌MS的潛伏時間約為150 min，爆發(fā)時間約為120min（圖2）。根據(jù)裂解量計(jì)算公式：裂解量＝爆發(fā)末期噬菌體滴度／感染初期噬菌體滴度，得出33D 感染宿主菌MS的裂解量為：24。

2.4 噬菌體理化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 噬菌體33D 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 圖3A 顯示噬菌體33D 在37℃條件下非常穩(wěn)定，隨時間延長滴度幾乎沒有明顯變化；60℃處理60 min后33D 的存活率僅為0.5%；70℃處理15min后33D 幾乎全部失活。

2.4.2 噬菌體33D 紫外線穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 在暴露在紫外線下的最初2min內(nèi)噬菌體33D 絕大多數(shù)失活，失活率達(dá)99%以上，此后延長照射時間到16 min依然有噬菌體存活。

圖2 分枝桿菌噬菌體33D一步生長曲線Fig.2 One－step growth curve for phage 33D

圖3 溫度（A）、pH 值（B，C）對噬菌體33D活力的影響Fig.3 Effects of temperature（A）and pH（B，C）on livability of phage 33D

2.4.3 噬菌體酒精穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 噬菌體33D 在75%的酒精中10min全部失活。

2.4.4 噬菌體33DpH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) pH 值對噬菌體33D 穩(wěn)定性具有顯著影響（圖3－B）：在pH6.0～8.0的范圍內(nèi)33D 的存活率在50%以上，在酸性和堿性環(huán)境下33D 的存活率明顯降低，pH4.0時和pH11.0時33D 的存活率均小于0.001%。

2.4.5 噬菌體裂解能力的pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 與pH值為7.4培養(yǎng)基比較pH 值為5 的培養(yǎng)基嚴(yán)重影響33D 裂解宿主菌的能力，但是依然有部分噬菌體能裂解宿主菌（圖3－C）。

2.4.6 噬菌體氯仿穩(wěn)定性試驗(yàn) 用等體積的氯仿處理20min后，噬菌體33D 滴度由處理前的1.1×109pfu／ml降低為1.0×106pfu／ml，99%以上的噬菌體失活。

2.5 噬菌體33D 寬噬實(shí)驗(yàn) 采用斑點(diǎn)法分別觀察噬菌體33D 與分枝桿菌分離株的寬噬效應(yīng)（表2），證實(shí)33D 除了能裂解mc2155、H37Rv，還能有效裂解分枝桿菌臨床分離株，裂解率高達(dá)93.8%。噬菌體33D 對耐藥MTB的裂解率高達(dá)95.65%。噬菌體33D 是寬噬噬菌體，對MTB的噬菌譜廣。

表2 噬菌體33D寬噬實(shí)驗(yàn)［n（×10－2）］Table 2 Broad lysing experiment of phage 33D

2.6 吸附常數(shù)的測定及交叉吸附常數(shù)的測定 將9株噬菌體與33D 的抗血清分別做中和試驗(yàn)和交叉中和試驗(yàn)，將測定結(jié)果代入公式得出相應(yīng)的K 值，見表3。

表3 噬菌體33D抗血清與9株噬菌體的中和實(shí)驗(yàn)和交叉中和實(shí)驗(yàn)Table 3 Neutralization test and cross neutralization test of phage 33D

從表3中可見，抗33D 血清稀釋1000倍后仍能有效中和33D 對宿主菌的吸附與感染（K＝703.80），但只稀釋10倍時才能中和DNAⅢ，Clark和Leo對宿主菌的吸附與感染，K 值分別是4.65，5.61和4.97；原液才能有效中和Legendre，TM4 和Sedge對宿主菌的吸附與感染，K 值分別為0.47，0.83，0.47；33D 抗血清即使不稀釋也無法有效中和BO4和D29對宿主菌的吸附與感染。

2.7 噬菌體33D 基因組特性的研究 用限制性內(nèi)切酶對噬菌體33D 的基因組進(jìn)行酶切分析的結(jié)果如圖4所示。33D 基因組核酸能被BamHⅢ切開，而BamHⅢ為雙鏈DNA 內(nèi)切酶，表明該基因組為雙鏈DNA。用kDNA／HindⅢ酶切片段作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合HindⅢ、BamHⅢ和EcoRⅠ酶切結(jié)果，初步測得噬菌體33D 的基因組大小為43.2kb。

圖4 噬菌體33D基因組酶切電泳圖Fig.4 Electrophoresis of 33Dgenome digested with EcoRⅠwith，HindⅢand BamHⅢ

3 討論

噬菌體作為一種抗菌劑，具有特異性強(qiáng)、自我增殖快、來源廣等一些其它抗菌劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)［9，10］。國內(nèi)已有關(guān)于分枝桿菌噬菌體D29治療結(jié)核病的報道［11，12］，但是D29已被注冊專利，且前期研究發(fā)現(xiàn)存在分枝桿菌耐D29現(xiàn)象。在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究33D基本生物學(xué)特征以及與宿主菌之間的作用規(guī)律，篩選宿主譜寬，與其它分枝桿菌噬菌體無交叉吸附表位的噬菌體，為分枝桿菌噬菌體雞尾酒療法抗耐藥結(jié)核研究奠定基礎(chǔ)［2］。

噬菌體分為烈性噬菌體和溫和噬菌體。噬菌體33D 形成的透明噬斑具有烈性噬菌體的噬斑特征。烈性噬菌體為天然的殺菌物質(zhì)。噬菌體33D 尾長約201 nm，依據(jù)國際病毒分類委員會2000年頒布的分類標(biāo)準(zhǔn)33D 屬于長尾噬菌體科（Siphoviridae），具有長尾的噬菌體能裂解MTB休眠菌。休眠菌是結(jié)核病復(fù)發(fā)和惡化的重要原因［13，14］。33D 有望成為殺滅休眠菌，減少結(jié)核病復(fù)發(fā)的新手段。

MOI是指初始感染時加入噬菌體的數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值，也稱感染倍數(shù)。不同的噬菌體具有不同的最佳MOI，本研究測得噬菌體33D 對其宿主菌MS的最低MOI為0.001，33D 對宿主菌MS極度易感［15］。

本實(shí)驗(yàn)測得噬菌體33D 感染宿主菌的潛伏期是150min，爆發(fā)期為120 min，較以往報道過的銅綠假單胞菌噬菌體PaP3和大腸桿菌噬菌體的一步生長周期長［16，17］。MS增殖速度慢可能是導(dǎo)致其噬菌體潛伏期和爆發(fā)期長的原因。理論上噬菌體侵染同一宿主菌時，若吸附快、潛伏期短，則溶菌周期短，因此通常認(rèn)為潛伏時間短的噬菌體具有較好的臨床應(yīng)用前景。關(guān)于噬菌體爆發(fā)量對裂解能力的影響目前存在爭議，有學(xué)者認(rèn)為爆發(fā)量大的噬菌體，會有效地對未裂解細(xì)胞進(jìn)行感染，溶菌效率相應(yīng)提高，噬菌體表現(xiàn)出較強(qiáng)的裂解能力［15］。爆發(fā)量小的噬菌體因其產(chǎn)生較少的子代就能導(dǎo)致宿主菌裂解［16］。因此，其裂解能力較強(qiáng)。但有待進(jìn)一步研究。

噬菌體33D 對溫度，紫外線，酒精均敏感?？捎靡陨戏椒▽κ删w33D 造成的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和器具污染進(jìn)行消毒。噬菌體33D 在儲存液中最適的pH 值為7，人體血液的PH 值（7.35－7.45）不會影響33D 存活和殺菌活力。雖然在PH 值為5 的環(huán)境中33D 裂解宿主菌的能力嚴(yán)重受損，但是依然有部分噬菌體能裂解宿主菌。鑒于人巨噬細(xì)胞內(nèi)吞體和溶酶體的pH 值為5左右［18，19］，我們推測33D 有可能具有殺滅胞內(nèi)菌的潛質(zhì)。氯仿對噬菌體有很強(qiáng)的殺滅能力，鑒于噬菌體33D 對氯仿敏感，我們有理由推測33D 的衣殼蛋白富含脂質(zhì)，33D 在制備過程中不能像其他噬菌體一樣用氯仿進(jìn)行抽提［4］。

噬菌體宿主識別的特異性在為微生物的鑒定和分型等方面做出貢獻(xiàn)的同時，也給利用噬菌體進(jìn)行抗菌治療和環(huán)境消毒等制造了麻煩。然而多價噬菌體的發(fā)現(xiàn)打破了特異性的束縛，為噬菌體的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。噬菌體33D 除了能夠裂解MS mc2155、MTB H37Rv，對于32 株分枝桿菌臨床分離株，33D可以裂解30株，寬噬率高達(dá)93.8%。而且33D 還對MDR－TB和XDR－TB株有很強(qiáng)的裂解能力。33D 對耐藥MTB的高裂解率，使得33D 對于治療耐藥結(jié)核具有很好的臨床運(yùn)用前景。

噬菌體感染宿主的首要步驟是吸附于菌細(xì)胞表面，而吸附過程可被相應(yīng)的抗血清抑制，抗血清K 值的高低與其噬菌體的抗原性密切相關(guān)，K 值越高抗原性越強(qiáng)［8］。33D 的K 值 為703.80，比D29 的K 值（1069.50）低，說明33D 抗原性較低，更不易被機(jī)體清除。噬菌體33D 的抗血清不能交叉中和我室從國外引進(jìn)的其余8株分枝桿菌噬菌體，這表明33D 與其余8株噬菌體在血清學(xué)上相關(guān)很小，它們之間不存在交叉吸附表位。即使9株噬菌體能感染同一宿主菌，它們的吸附表位也不一樣，各自通過不同的特異性吸附表位與宿主菌相互作用而感染宿主菌。噬菌體33D可與其他分枝桿菌噬菌體組合作為治療耐藥結(jié)核的“噬菌體雞尾酒療法”配方。與大多數(shù)有尾噬菌體一樣，噬菌體33D 的基因組為雙鏈DNA 分子，基因組DNA 大小約為43kb。該基因組的實(shí)際大小只有在完成測序之后才能最終確定，而基因組大小的估計(jì)是預(yù)計(jì)測序工作量的重要依據(jù)。基因測序?qū)檫M(jìn)一步分析33D 是否含有毒力基因，耐藥基因提供依據(jù)。

4 結(jié)論

33D 尾長201nm，最佳MOI為10－5，感染宿主菌的潛伏期約為150min，裂解量為24；33D 對紫外線、酸堿、酒精、氯仿、溫度敏感；33D 能裂解多數(shù)分枝桿菌臨床耐藥株；33D 抗血清反應(yīng)吸附常數(shù)K 值為703.80。33D 屬于長尾噬菌體科（siphoviridae），抗原性較低，裂解譜廣，具有抗耐藥結(jié)核潛力。

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