朱濤 葉春燕 文富強(qiáng) 張維

（1.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸病學(xué)研究室／呼吸內(nèi)科，成都，四川，610041；2.成都市金牛區(qū)人民醫(yī)院；3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，成都，四川，610000）

支氣管哮喘（bronchial asthma，簡(jiǎn)稱哮喘），是一種由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的非特異性氣道炎癥性疾?。?－6］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)目前全球哮喘患者接近3億人，且哮喘的發(fā)病率存在上升趨勢(shì)［1－6］。近年的研究均提示Th1／Th2免疫應(yīng)答失衡在哮喘的發(fā)病過(guò)程中扮演著重要的角色［7－9］。研究發(fā)現(xiàn)糾正Th1／Th2免疫應(yīng)答失衡對(duì)哮喘的炎癥水平及肺功能有改善作用［10－12］。他汀類(lèi)藥物對(duì)哮喘相關(guān)的氣道炎癥作用有顯著的抑制作用，并認(rèn)為該作用可能與調(diào)節(jié)Th1／Th2免疫應(yīng)答失衡密切相關(guān)［13，14］。本研究的目的是探討瑞舒伐他汀輔助治療對(duì)于成年支氣管哮喘患者Th1／Th2免疫應(yīng)答失衡、炎癥水平和肺功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本試驗(yàn)采用單盲、雙模擬、單中心、隨機(jī)陽(yáng)性對(duì)照方法進(jìn)行。按照診斷標(biāo)準(zhǔn)［15］，將我院2011年3月至2014年10月初次診斷的100例成年的中到重度成年哮喘患者，隨機(jī)平均分為治療組和對(duì)照組（n＝50）。治療組男29例，女21例，年齡（48.2±16.5）歲。對(duì)照組，男31 例，女19 例，年 齡（50.6±17.4）歲。哮喘病史皆大于5年。兩組患者在年齡、病程和病情等方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。同時(shí)患者均被詳細(xì)告知實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)方法及存在的潛在不良反應(yīng)，并簽字同意。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除標(biāo)準(zhǔn)包括：實(shí)驗(yàn)前6 個(gè)月因急性加重住院治療；實(shí)驗(yàn)前4周有除哮喘外的其他呼吸系統(tǒng)疾病或下呼吸道感染；實(shí)驗(yàn)前6 個(gè)月仍吸煙，或雖已戒煙但有10年以上吸煙史；有其他變應(yīng)性鼻炎、寄生蟲(chóng)感染、嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)性支氣管炎和嗜酸細(xì)胞增多癥等血中可檢出嗜酸性粒細(xì)胞增高的其他疾病；嚴(yán)重的心、肝、腎功能不全；難以控制的高血壓；Ⅰ型糖尿??；活動(dòng)性肺結(jié)核；惡性腫瘤等其他嚴(yán)重疾??；妊娠狀態(tài)或哺乳期婦女；不愿參加者。

1.3 治療方法 在患者哮喘教育、環(huán)境控制和按需使用沙丁胺醇吸入劑緩解癥狀的基礎(chǔ)上，給予布地奈德福莫特羅粉吸人劑（信必可都保，阿斯利康公司），（160μg／4.5μg）／吸，2吸／天的導(dǎo)入期（run－in period）治療14天后。對(duì)照組使用布地奈德福莫特羅粉吸人劑（160μg／4.5μg）／吸，2吸／天，并給予安慰劑。試驗(yàn)組使用布地奈德福莫特羅粉吸人劑（160μg／4.5μg）／吸，2吸／天的基礎(chǔ)上加用瑞舒伐他汀鈣片（阿斯利康公司），20mg／天進(jìn)行治療。干預(yù)時(shí)間為13 周。沙丁胺醇為唯一急救藥物。在該臨床研究過(guò)程中未見(jiàn)與治療藥物相關(guān)的嚴(yán)重的不良反應(yīng)發(fā)生。

1.4 肺功能檢測(cè) 兩組均于治療前及治療13 周后進(jìn)行肺功能測(cè)定。吸入200μg沙丁胺醇15min后測(cè)定FEV1占預(yù)計(jì)值%和PEF個(gè)人最佳值%。

1.5 血中IL－4、IL－5和IL－13水平檢查 取患者于治療前與治療13周后清晨空腹靜脈血。根據(jù)ELISA 試劑盒（R＆D Systems，USA）說(shuō)明書(shū)方法，對(duì)血中IL－4、IL－5和IL－13水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 血細(xì)胞中GATA－3 mRNA 表達(dá)分析 在治療前和治療13 周后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取血細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 反 應(yīng)。GATA－3 正 義5′－ACTAC GGAAACT CGGTCAGG－3′，反 義5′－CAGGGT AGGGA TCCATGAAG－3′；β－actin正義：5′－ACTTAGTTG CGTTA CACC CTT－3′，反義：5′－GTCAC CTTCACC GTTCCA－3′。使用β－actin作為內(nèi)參基因，使用2－△△CT公式計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。ΔΔCt＝（Ct，目標(biāo)－Ct，β－actin）干預(yù)組－（Ct，目標(biāo)－Ct，β－actin）對(duì)照組。

1.7 血細(xì)胞中T－bet和GATA－3蛋白表達(dá)分析 對(duì)患者治療前和治療13周后血細(xì)胞中GATA－3蛋白的表達(dá)水平使用western blot法進(jìn)行檢測(cè)。按照試劑盒操作要求，首先提取血液中總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入GATA－3 抗體（1∶800）和β－actin 抗體（1∶1200），4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2000），用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算數(shù)據(jù)使用（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FEV1占預(yù)計(jì)值和PEF 個(gè)人最佳值 經(jīng)13周治療后兩組患者FEV1占預(yù)計(jì)值和PEF 個(gè)人最佳值較治療前均有明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）；且干預(yù)組較對(duì)照組改善更加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 血中IL－4、IL－5 和IL－13 水平測(cè)定 通過(guò)治療13周后，2組患者血中IL－4、IL－5和IL－13水平均較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）；且干預(yù)組患者下降更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 FEV1占預(yù)計(jì)值%和PEF個(gè)人最佳值%比較（，n＝50）Table 1 FEV1%and PEF%in the two group

表1 FEV1占預(yù)計(jì)值%和PEF個(gè)人最佳值%比較（，n＝50）Table 1 FEV1%and PEF%in the two group

注：治療前比較①P＜0.05；與對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較②P＜0.05。

表2 血中IL－4、IL－5和IL－13水平（，n＝50）Table 2 The serum levels of IL－4，IL－5and IL－13in the two groups

表2 血中IL－4、IL－5和IL－13水平（，n＝50）Table 2 The serum levels of IL－4，IL－5and IL－13in the two groups

注：與治療前比較①P＜0.05；與對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較②P＜0.05。

2.3 血細(xì)胞中GATA－3的表達(dá)水平 通過(guò)治療13周后，2組患者血細(xì)胞中GATA－3mRNA 和蛋白的表達(dá)較治療前顯著降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。同時(shí)，干預(yù)組各指標(biāo)較對(duì)照組改善更加明顯，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜005）。見(jiàn)表3，圖1。

表3 血細(xì)胞中T－bet和GATA－3mRNA和蛋白的表達(dá)水平（，n＝50）Table 3 The mRNA and protein expression of T－bet and GATA－3in blood cells

表3 血細(xì)胞中T－bet和GATA－3mRNA和蛋白的表達(dá)水平（，n＝50）Table 3 The mRNA and protein expression of T－bet and GATA－3in blood cells

注：與治療前比較①P＜0.05；與對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較②P＜0.05。

圖1 血細(xì)胞中GATA－3蛋白表達(dá)水平結(jié)果Figure 1 The western blot results of the protein expression of GATA－3in blood cells

3 討論

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球哮喘兒童發(fā)病率為3.3%～29%，成人為1.2%～25.5%［1－6，16］。未得到有效控制的哮喘患者，氣道炎癥反應(yīng)逐步加重，可進(jìn)展為不完全可逆性通氣功能障礙，全球每年因哮喘致死的患者接近2萬(wàn)人［1－6，16］。近年來(lái)隨著 全球哮喘 防治創(chuàng)議（The Global Initiative for Asthma，GINA）的普及以及吸入激素加長(zhǎng)效β2激動(dòng)劑聯(lián)合藥物（ICS＋LABA）的推廣，哮喘患者的臨床控制水平有了較大幅度的提高，但由于哮喘復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制、患者機(jī)體不同的免疫狀態(tài)以及個(gè)體差異等因素的存在使治療效果具有明顯的異質(zhì)性，再加上藥物相關(guān)的不良反應(yīng)限制了藥物的應(yīng)用，這些因素共同影響了哮喘患者的療效和預(yù)后，統(tǒng)計(jì)顯示哮喘的急性發(fā)作率和住院率并未見(jiàn)顯著下降［1－6，16］。因此，有必要從哮喘發(fā)病的根本機(jī)制入手尋求新的治療藥物，阻止疾病進(jìn)展，使哮喘患者獲得更佳的臨床控制。

他汀類(lèi)藥物對(duì)哮喘動(dòng)物模型有保護(hù)作用［16－19］。瑞舒伐他汀可以通過(guò)下調(diào)Th2 細(xì)胞因子（IL－4、IL－5和IL－13）分泌顯著抑制小鼠氣道炎癥反應(yīng)和粘液的過(guò)度分泌［16］?？蓽p輕哮喘小鼠炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并能明顯降低BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞比例和TNF－α 的濃度［19］。我們?cè)诮o予中到重度的成年哮喘患者ICS／LABA 的基礎(chǔ)治療上對(duì)干預(yù)組患者給予瑞舒伐他汀20mg／天的輔助治療，該結(jié)果表明瑞舒伐他汀輔助治療能夠有效改善中到重度的成年哮喘患者的肺功能狀態(tài)。

哮喘被認(rèn)為是與T 細(xì)胞介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)密切相關(guān)的氣道炎癥性疾病。肺組織內(nèi)抗原提呈細(xì)胞（APC）吞噬處理抗原后將抗原信息呈遞給靜息型T細(xì)胞（naive T cells），誘導(dǎo)其分化為T(mén)h1和Th2效應(yīng)性T 細(xì)胞參與細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。在哮喘患者氣道中原有的Th1／Th2 免疫應(yīng)答平衡出現(xiàn)了Th2 偏移，過(guò)度活化增殖的Th2細(xì)胞可分泌IL－4、IL－5和IL－13等多種炎癥介質(zhì)。同時(shí)Th2細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)具有趨化募集嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）至抗原入侵部位誘發(fā)氣道高反應(yīng)性；直接和間接刺激氣道柱狀上皮的杯狀上皮化生導(dǎo)致粘液過(guò)度分泌；誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒；誘導(dǎo)B細(xì)胞過(guò)度活化增殖及IgE 釋放的作用。以上因素最終導(dǎo)致哮喘患者氣道炎癥的持續(xù)與急性發(fā)作，也是導(dǎo)致氣道重構(gòu)的重要原因［20，21］。目前認(rèn)為T(mén)h2免疫應(yīng)答增強(qiáng)和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色［16－24］。研究發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物可通過(guò)下調(diào)MHC II相關(guān)分子表達(dá)，抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞的活化［13，14］。Mira等發(fā)現(xiàn)洛伐他汀可通過(guò)CCL1通路增加負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞Treg的數(shù)量，促使Th1／Th2平衡的重建［13］。我們的臨床研究發(fā)現(xiàn)在給予有效治療后哮喘患者血中IL－4、IL－5和IL－13水平均較治療前顯著降低（P 均＜0.05），且干預(yù)組患者指標(biāo)降低更加顯著（P 均＜0.05）。該結(jié)果表明對(duì)于中到重度的成年哮喘患者瑞舒伐他汀輔助治療能夠有效抑制哮喘相關(guān)的炎癥反應(yīng)。

GATA－3是調(diào)節(jié)Th0向Th2細(xì)胞分化的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)因素，GATA－3 表達(dá)的增加與Th1／Th2免疫應(yīng)答時(shí)Th2失衡程度呈正相關(guān)性［7－9，12］。在本臨床實(shí)驗(yàn)中我們使用qPCR 和western blot法對(duì)哮喘患者血細(xì)胞中GATA－3的mRNA 和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)在有效的干預(yù)后中到重度的成年哮喘患者血細(xì)胞中GATA－3的表達(dá)均有顯著的降低，且干預(yù)組患者降低的程度更加明顯。該結(jié)果表明瑞舒伐他汀對(duì)哮喘患者Th1／Th2免疫應(yīng)答失衡有顯著的改善作用。同時(shí)在該臨床研究過(guò)程中我們未見(jiàn)與治療藥物相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。

4 結(jié)論

瑞舒伐他汀可以通過(guò)糾正Th1／Th2免疫失衡改善支氣管哮喘的炎癥水平和肺功能。該臨床實(shí)驗(yàn)為瑞舒伐他汀應(yīng)用于支氣管哮喘的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。但仍需進(jìn)一步的多中心大樣本量臨床研究明確其價(jià)值和意義。

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