牟界 王杰 張文斌 雷文匯

（重慶市中醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400011）

致炎因子和炎癥介質(zhì)導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelium）損傷是膿毒血癥（sepsis）、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）以及冠狀動(dòng)脈硬化性心臟?。╟oronary arteriosclerotic heart disease，CAD）等炎癥性疾病共同的病理生理特征［1－5］。目前認(rèn)為，改善和減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是治療膿毒血癥、ARDS 和CAD 等炎癥性疾病的關(guān)鍵［6，7］。山柰酚（kaempferol）屬于黃酮 類化合物（flavonoid），在包括綠茶、西蘭花和藏紅花等多種植物中廣泛存在［8－11］。目前研究發(fā)現(xiàn)山柰酚具有抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激、抑制細(xì)菌病毒生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)腫瘤增殖和侵襲以及調(diào)節(jié)糖代謝等廣泛的藥理作用［8－11］。同時(shí)Kim TH 等的研究發(fā)現(xiàn)山柰酚抑制炎癥反應(yīng)的機(jī)制與抑制高遷移率族蛋白1（High mobility group box－1protein，HMGB1）密切相關(guān)，但具體的分子機(jī)制并不明確［12］。本研究旨在探討山柰酚對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）炎癥反應(yīng)的影響及其潛在分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 TRIzol試劑和qPCR 試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司；鼠抗人HO－1抗體、鼠抗人HMGB1抗體和鼠抗人β－actin抗體均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；山柰酚購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，小牛血清購(gòu)于杭州四季清，其余試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）常規(guī)接種在含10%胎牛血清、100g／L 青霉素、100g／L 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48h換液、傳代2次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為對(duì)照組（Control組）、LPS組和LPS＋山柰酚（LPS＋KF組）。其中對(duì)照組細(xì)胞加入PBS；LPS組和LPS＋KF組加入終濃度為1μg／ml的LPS；LPS＋KF組加入終濃度為80μM 的山柰酚溶液進(jìn)行干預(yù)［13］。

1.3 細(xì) 胞HMGB1 和HO－1 mRNA 表達(dá)檢測(cè)qPCR 法檢測(cè)HMGB1和HO－1mRNA 表達(dá)水平，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞的總RNA 并合成cDNA。然后進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μl，使用β－actin作為內(nèi)參照。引物序列如下：HMGB1正義5′－TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA－3′，反 義5′－GCATT AGCTTCAGAT TTACGGGT－3′；HO－1 正義5′－GGCTG ACAAGG CTCGTTATG－3′，反義5′－GGGC GGTACTCAGAA CAGAAC－3′；β－actin：正義：5′－CCCAG CACAATGA AGATCAAGA TCAT－3′，反義：5′－ATCTG CTGGAAGGT GGACAGCGA－3′。使用2－ΔΔCt法對(duì)MCP－1和HMGB1 mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，ΔΔCt ＝（Ct，目標(biāo)－Ct，β－actin）干預(yù)組－（Ct，目標(biāo)－Ct，β－actin）對(duì)照組。

1.4 Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1 和HO－1蛋白表達(dá)水平 干預(yù)24h后，按照試劑盒操作要求，首先提取HUVECs細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入鼠抗人抗體HMGB1（1∶900）、HO－1（1∶800）和β－actin（1∶1500），4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1000），用ECL 進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1 mRNA 和蛋白的表達(dá) 干預(yù)24h 后，使用qPCR 法和western blot法對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HMGB1mRNA 和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。與對(duì)照組相比較，在LPS 干預(yù)后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HMGB1mRNA 和蛋白的表達(dá)水平明顯增加，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。但LPS組較LPS＋山柰酚組HMGB1mRNA 和蛋白的表達(dá)增加更加明顯，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05），見表1和圖1。

表1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HO－1和HMGB1mRNA和蛋白表達(dá)水平（n＝5，）Table 1 The mRNA and protein expression of HO－1and HMGB1in HUVECs

表1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HO－1和HMGB1mRNA和蛋白表達(dá)水平（n＝5，）Table 1 The mRNA and protein expression of HO－1and HMGB1in HUVECs

注：①與對(duì)照組相比較P＜0.05；②與LPS組相比較P＜0.05。

圖1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)的western blot結(jié)果Figure 1 The western blot results of HMGB1protein expression in HUVECs

圖2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HO－1蛋白表達(dá)的western blot結(jié)果Figure 2 The western blot results of HO－1protein expression in HUVECs

2.2 HO－1mRNA 和蛋白的表達(dá) 表1和圖2可知，干預(yù)24h后，使用qPCR 法和western blot法對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HO－1mRNA 和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。與對(duì)照組相比較，在LPS干預(yù)后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HO－1mRNA 和蛋白的表達(dá)水平明顯降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。但LPS 組較LPS＋山柰酚組HO－1 mRNA 和蛋白的表達(dá)下降更加明顯，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelium）主要是指內(nèi)襯于血管最內(nèi)側(cè)的單層扁平上皮細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅僅具有維持血管壁結(jié)構(gòu)完整性的作用，還廣泛參與了凝血與抗凝調(diào)節(jié)、免疫炎癥調(diào)節(jié)、組織再生、血壓以及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等多種生理和病理過程［4－7，14］。目前認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞是膿毒血癥、ARDS以及動(dòng)脈粥樣硬化等炎癥性疾病的主要損傷部位［4－7，14］。同時(shí)，大量研究證實(shí)抑制和減輕炎癥因子導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)于改善膿毒血癥、ARDS以及動(dòng)脈粥樣硬化等炎癥性疾 病均具有 積極作用［4－7，14－18］。Lee W等研究證實(shí)穿心蓮內(nèi)酯可以通過抑制HMGB1 表達(dá)對(duì)膿毒血癥狀態(tài)下的小鼠具有保護(hù)作用，并認(rèn)為與改善血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)［15］。何健卓等的研究發(fā)現(xiàn)血必凈注射液可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改善膿毒血癥患者的微循環(huán)狀態(tài)和血流動(dòng)力學(xué)異常［16］。Qin M 等研究顯示楊梅樹皮苷可以通過PI3K／Akt信號(hào)通路減輕ox－LDL 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生保護(hù)作用［17］。Zhang Y等的研究發(fā)現(xiàn)miR－26a可以通過調(diào)節(jié)TRPC6表達(dá)改善ox－LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［18］。以上實(shí)驗(yàn)表明血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)在膿毒血癥和動(dòng)脈粥樣硬化等炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色，減輕和改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷對(duì)于治療炎癥性疾病具有積極的意義和價(jià)值。

山柰酚（kaempferol）屬于黃酮類化合物（flavonoid），在多種蔬菜和水果中均發(fā)現(xiàn)山柰酚的存在。目前大量的研究表明山柰酚及其衍生化合物具有抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激、抑制細(xì)菌和病毒生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)腫瘤增殖和侵襲以及調(diào)節(jié)糖代謝等廣泛的藥理作用［8－12，19，20］。Yang QS等的研究發(fā)現(xiàn)山柰酚可以通過抑制TNF－α和IL－6等炎癥介質(zhì)的表達(dá)和過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)失血性休克小鼠多個(gè)器官產(chǎn)生保護(hù)作用［11］。同時(shí)，Chung MJ等的研究發(fā)現(xiàn)山柰酚及其衍生物對(duì)于卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)有顯著的抑制作用［19］。Tang XL 等的研究證實(shí)山柰酚可以有效抑制LPS和ATP誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)［20］。進(jìn)一步Kim TH 等的研究發(fā)現(xiàn)山柰酚抑制炎癥反應(yīng)的機(jī)制與下調(diào)高遷移率族蛋白1（High mobility group box－1protein，HMGB1）密切相關(guān)，但具體的分子機(jī)制仍不明確。

血紅素氧化酶－1（heme oxygenase－1，HO－1）又稱為熱休克蛋白32（heat shock protein 32），其分子量為32kD，屬 于熱休克蛋白家族成員之一［21，22］。HO－1廣泛存在于細(xì)胞的微粒體中，主要參與自由鐵、一氧化碳和膽綠素等的代謝過程。目前研究發(fā)現(xiàn)HO－1同時(shí)還參與了炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控［21，22］。在炎癥狀態(tài)下上調(diào)HO－1 的合成與表達(dá)對(duì)于改善細(xì)胞和器官功能有積極作用［21，22］。近期研究表明HO－1 是HMGB1重要的調(diào)節(jié)因素［21，22］。Li Y等的研究發(fā)現(xiàn)在小鼠ARDS模型中氫氣可以通過上調(diào)HO－1的合成抑制HMGB1 的表達(dá)改善肺組織的炎癥反應(yīng)，并改善模型動(dòng)物的死亡率［21］。Kim YM 等的研究也證實(shí)在巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中甘草皂苷可以通過上調(diào)HO－1 的合成抑制LPS 誘導(dǎo)的HMGB1的表達(dá)［22］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中山柰酚可能可以通過上調(diào)HO－1的合成抑制LPS誘導(dǎo)的HMGB1的表達(dá)。

4 結(jié)論

山柰酚可能可以通過上調(diào)HO－1抑制LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）HMGB1的表達(dá)，提示山柰酚對(duì)炎癥狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究為山柰酚應(yīng)用于膿毒血癥和ARDS等炎性疾病的治療奠定了一定的基礎(chǔ)。

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