左 霞，郭俐宏，李 莉

(1. 湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000;2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院,湖北 十堰 442000)

百令膠囊對(duì)腎移植大鼠腎功能及排斥反應(yīng)的影響

左 霞1，郭俐宏1，李 莉2

(1. 湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000;2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院,湖北 十堰 442000)

目的 觀察百令膠囊對(duì)左腎移植大鼠腎功能及排斥反應(yīng)的影響。方法 將80只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、環(huán)孢菌素A組、百令膠囊組，每組20只。除假手術(shù)組外,其余3組均進(jìn)行同種異體左腎移植術(shù)。術(shù)后百令膠囊組給予百令膠囊20 mg/kg灌胃并腹腔注射環(huán)孢菌素A 2.0 mg/(kg·d)，環(huán)孢菌素A組注射環(huán)孢菌素A 2.0 mg/(kg·d),假手術(shù)組及模型組僅灌等體積生理鹽水，1次/d,均連續(xù)灌胃3周。測定治療前后4組大鼠血清胱抑素C(Cys C)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、內(nèi)源性超氧化物歧化酶(SOD)、免疫球蛋白G(IgG) 、全血T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量，并統(tǒng)計(jì)大鼠存活時(shí)間及存活率。結(jié)果 百令膠囊組血清Cys C、BUN、Cr、MDA、LDH水平及T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量均明顯降低，血清SOD、IgG水平升高，大鼠存活時(shí)間及存活率明顯提高，與模型組及環(huán)孢菌素A組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 百令膠囊可明顯抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高SOD活性，清除腎移植術(shù)后MDA，提高免疫功能,可增強(qiáng)環(huán)孢菌素A抗排異反應(yīng)藥效，促進(jìn)腎功能恢復(fù)，提高大鼠存活時(shí)間及存活率，對(duì)移植腎有一定的保護(hù)作用。

大鼠; 百令膠囊；腎移植；免疫調(diào)節(jié)；腎功能

冬蟲夏草為生長在西藏高海拔地區(qū)的獨(dú)特物種，為麥角菌科真菌寄生在蝙蝠娥科昆蟲幼蟲的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體。《本草從新》記載冬蟲夏草具有“保肺、益腎、止血、化痰、已勞咳，治膈癥皆良”等功效，是我國傳統(tǒng)的滋補(bǔ)中藥[1]。百令膠囊是人工培養(yǎng)麥角菌科真菌冬蟲夏草無性型中華柬絲孢子，經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝發(fā)酵制成蟲草菌糖膠囊，主要成分有腺苷、蟲草素、蛋白質(zhì)、多種氨基酸、糖及多種維生素、微量元素等，其藥理作用與天然蟲草基本一致[2]，常用于多病因造成的慢性腎功能不全及藥物腎毒等急性腎功能損害的輔助性治療。本實(shí)驗(yàn)主要觀察了百令膠囊對(duì)腎移植術(shù)大鼠腎功能及腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)的影響，旨在為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)大鼠80只，鼠齡45～60周，體質(zhì)量(180±20)g，雄性，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證SYXK(鄂)2011-0031，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(鄂)2011-0008。將80只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、環(huán)孢菌素A組、百令膠囊組，每組20只，即供、受體各10只。

1.2 藥品試劑及儀器 百令膠囊(杭州中美華東制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10910036)，環(huán)孢菌素A (上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：59865-13-3)，血清丙二醛(MDA)、血清乳酸脫氫酶(LDH)及血清內(nèi)源性超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，雙人雙目手術(shù)顯微鏡(鎮(zhèn)江醫(yī)用光學(xué)儀器廠)，日立7150型全自動(dòng)生化分析儀(日立精密儀器株式會(huì))，氯胺酮、乳酸林格氏液(自制)，無損傷縫合線(9/0、6/0，上海醫(yī)用縫合線廠生產(chǎn))。

1.3 大鼠左腎同種異體移植手術(shù)方法及給藥方法 參照文獻(xiàn)[3]，模型組、百令膠囊組供、受體大鼠術(shù)前均禁食12 h，自由飲水，稱質(zhì)量，按100 mg/kg 腹腔注射20%氯胺酮麻醉。供體仰臥腹部向上固定于大鼠固定器，腹部正中切口，充分暴露左腎、輸尿管及主動(dòng)脈、腔靜脈，手術(shù)顯微鏡下游離左腎，結(jié)扎并切斷左腎動(dòng)、靜脈，自陰莖背靜脈注射125 IU/mL腎素鹽水0．5 mL腎素化，自腹主動(dòng)脈遠(yuǎn)端穿刺用4 ℃乳酸林格氏液連續(xù)灌注到左腎呈黃白后置4℃器官保存冰盒中備用。受體手術(shù)同上，將供體左腎移植給受體，吻合腎動(dòng)、靜脈及神經(jīng)，無損傷縫合線縫合，術(shù)后分層關(guān)閉腹腔。每日碘伏消毒1次傷口，青霉素80萬IU/(100g·d)肌肉注射預(yù)防感染，連續(xù)1周。假手術(shù)組手術(shù)過程同上，但不進(jìn)行移植手術(shù)。術(shù)后百令膠囊組給予百令膠囊20 mg/kg灌胃并腹腔注射環(huán)孢菌素A 2.0 mg/(kg·d)，環(huán)孢菌素A組注射環(huán)孢菌素A 2.0 mg/(kg·d)，假手術(shù)及模型組僅灌等體積生理鹽水，1次/d,均連續(xù)灌胃3 周。術(shù)后保持動(dòng)物房溫度18～25 ℃，濕度50%～80%，大鼠單籠飼養(yǎng)，12 h交替光照使盡快復(fù)溫，動(dòng)物蘇醒后自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每日觀察動(dòng)物進(jìn)食情況，稱體質(zhì)量，及時(shí)清理糞便，消毒護(hù)理時(shí)盡量減少動(dòng)物的疼痛和不適等人道主義措施[4]。在實(shí)驗(yàn)過程中倡導(dǎo)人道的使用和管理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，盡量滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求[5]。

1.4 檢測指標(biāo) 灌胃第3周按文獻(xiàn)[6]方法心臟取血，采用日立7150型全自動(dòng)生化分析儀測定血清胱抑素C(Cys C)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平及全血T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量，嚴(yán)格按試劑盒說明測定血清MDA、LDH、SOD及IgG水平。統(tǒng)計(jì)各組大鼠存活率及存活時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 術(shù)后3 周，假手術(shù)組無動(dòng)物死亡，大鼠體毛均有光澤，對(duì)光及聲音反應(yīng)敏捷，飲食及飲水量正常，體質(zhì)量無變化。模型組術(shù)后1周有6只死亡，3 周后僅有2只存活，3 周存活率為20%；存活大鼠精神及自潔情況極差，體毛脫落無光澤，蜷縮少動(dòng)，攝食及飲水量少，體質(zhì)量降低35%。環(huán)孢菌素A組術(shù)后1周有3只死亡，3 周后有5只存活，3 周存活率為50%；存活大鼠精神及自潔情況較模型組稍好，體質(zhì)量降低32%。百令膠囊組術(shù)后1周有2只死亡，3周后有7只存活，3 周存活率為70%；存活大鼠精神及自潔情況較模型組稍好，但體毛無光澤，舔足，拒絕活動(dòng)，攝食及飲水量少，體質(zhì)量降低30%。

2.2 各組大鼠血清MDA、LDH及SOD水平比較 假手術(shù)組治療前后血清MDA、LDH及SOD水平均正常。腎移植3 周后，模型組血清MDA、LDH水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，SOD水平明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；環(huán)孢菌素A組血清MDA、LDH水平明顯低于模型組(P均<0.05)，SOD水平高于模型組(P<0.05)，但均未恢復(fù)正常水平；百令膠囊組血清MDA、LDH水平均明顯低于模型組及環(huán)孢菌素A組(P均<0.05)，但均未恢復(fù)正常水平。見表1。

2.3 各組大鼠血清Cys C、Cr、BUN水平比較 假手術(shù)組治療前后血清Cys C、Cr、BUN水平均正常。腎移植3 周后，模型組血清Cys C、Cr、BUN水平均明顯高于假手術(shù)組(P均 <0.05)；環(huán)孢菌素A組血清Cys C、Cr、BUN水平均低于模型組(P均 <0.05)，但未恢復(fù)到正常水平；百令膠囊組血清Cys C、Cr、BUN水平均明顯低于模型組及環(huán)孢菌素A組 (P均<0.05)，但均未恢復(fù)正常水平。見表2。

表1 各組大鼠血清MDA 、LDH及SOD水平比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05;②與模型組比較，P<0.05；③與環(huán)孢菌素A組比較,P<0.05。

表2 各組大鼠血清Cys C、Cr、BUN水平比較

注：①假手術(shù)組比較，P<0.05;②與模型組比較，P<0.05；③與環(huán)孢菌素A組比較,P<0.05。

2.4 各組大鼠T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及IgG比較 假手術(shù)組治療前后T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量及IgG水平均正常。腎移植3 周后，模型組T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，IgG水平正常；環(huán)孢菌素A組T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量均明顯低于假手術(shù)組及模型組(P均<0.05)，IgG水平則無明顯變化；百令膠囊組T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量均明顯低于模型組及環(huán)孢菌素A組(P均<0.05)；IgG水平則明顯高于環(huán)孢菌素A組及模型組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及IgG水平比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05;②與模型組比較，P<0.05；③與環(huán)孢菌素A組比較,P<0.05。

3 討 論

臨床上大手術(shù)、創(chuàng)傷、燒傷、器官移植、藥物腎毒等均可能造成急性腎功能損害，在臨床治療過程中常造成嚴(yán)重后果而危及生命。其病理生理基礎(chǔ)是由于器官移植手術(shù)損傷較大，術(shù)中存在失血，術(shù)后血液再通常造成腎急性缺血/再灌注損傷，腎功能損害嚴(yán)重，同時(shí)因術(shù)后未能及時(shí)控制排斥反應(yīng)、臨床療效不佳、器官移植后巨細(xì)胞病毒感染、CsA腎毒性等免疫學(xué)或非免疫學(xué)因素的存在，均有可能誘發(fā)腎功能的急性損傷[7]。此類患者腎功能指標(biāo)如Cys、BUN及Cr均較高。同時(shí)，腎移植手術(shù)所造成的急性腎缺血/再灌注損傷后氧自由基大量產(chǎn)生，引起強(qiáng)烈的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，血清中可檢測出大量脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物MDA。 SOD是清除自由基的一種特性酶，可清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受自由基損害，故測定MDA可間接反映細(xì)胞受氧自由基損傷的程度，SOD可以證明藥物治療過程中的抗氧化功能。LDH是一種參與糖無氧酵解和糖異生的重要酶，主要存在于腎臟組織中，腎移植排異時(shí)，血清LDH增高。而T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及IgG參與排異反應(yīng)時(shí)的細(xì)胞免疫及體液免疫過程。故本實(shí)驗(yàn)將MDA、LDH、SOD及Cys C 、Cr、BUN、T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量及IgG作為觀察指標(biāo)來評(píng)價(jià)療效。

百令膠囊具有增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、抗纖維化、保護(hù)腎功能、抗腫瘤、抗炎等作用，對(duì)腎臟、肺臟、腎等臟器有保護(hù)作用[8]。其主要成分冬蟲夏草有抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗脂質(zhì)代謝作用，其腺苷可使SOD升高，清除自由基，降低脂質(zhì)過氧化物，改善腎血流，改善腎功能[9]。馬瑞霞等[10]證實(shí)冬蟲夏草可抑制大鼠器官移植時(shí)細(xì)胞凋亡及凋亡基因FasImR-A的表達(dá)，可顯著抑制大鼠小腸移植排斥反應(yīng)，且抑制細(xì)胞凋亡具有相加或協(xié)同作用。Yu等[11]報(bào)道百令膠囊可降低T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞吞噬功能，對(duì)實(shí)質(zhì)器官進(jìn)行選擇性排異抑制的同時(shí)，反而升高血清IgG，是一種較理想的免疫調(diào)節(jié)劑，其雙向免疫調(diào)節(jié)作用可增強(qiáng)環(huán)孢菌素A抗排異反應(yīng)藥效[12]。

環(huán)孢菌素A主要用于肝、腎以及心臟移植的抗排異反應(yīng)，可與腎上腺皮質(zhì)激素同用，也可用于一些免疫性疾病的治療。環(huán)孢菌素 A 發(fā)揮作用的主要機(jī)制是環(huán)孢菌素 A 與親環(huán)孢素形成復(fù)合物再與依賴鈣/鈣結(jié)合蛋白的鈣調(diào)磷酸酶作用，抑制活化 T 細(xì)胞核因子的去磷酸化使其不能進(jìn)入核內(nèi)，從而抑制 IL-2 的產(chǎn)生，使T 淋巴細(xì)胞的生成受抑制，降低T 淋巴細(xì)胞的吞噬作用[13]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療3 周后，百令膠囊組血清Cys C 、Cr、BUN、MDA 、LDH水平及全血T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量均明顯低于模型組及環(huán)孢菌素A組，SOD及IgG水平明顯高于模型組及環(huán)孢菌素A組。提示百令膠囊聯(lián)合環(huán)孢菌素A可明顯抑制腎移植大鼠MDA、LDH的產(chǎn)生,提高SOD活性及IgG合成 ，說明百令膠囊確有抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抑制MDA 及LDH產(chǎn)生、清除自由基的作用，這與池艷春等[14]報(bào)道百令膠囊抗氧化作用相一致。分析認(rèn)為其作用機(jī)制可能與百令膠囊保護(hù)腎小管細(xì)胞Na+,K+-ATP酶，減輕腎急性缺血/再灌注時(shí)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成的組織器官損傷，促進(jìn)損傷腎小管細(xì)胞增殖及修復(fù)，抑制腎小球的代償性肥大，同時(shí)抑制醛糖還原酶，減輕早期腎小球?qū)a、K高濾過病理改變等有關(guān)[15]。目前百令膠囊是免疫抑制劑還是免疫調(diào)節(jié)劑尚無一致結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，百令膠囊可促進(jìn)IgG合成，提高了腎移植后體液免疫力，但同時(shí)降低了全血T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量,抑制了細(xì)胞免疫。故本研究認(rèn)為百令膠囊是免疫調(diào)節(jié)劑，在進(jìn)行選擇性細(xì)胞免疫抑制的同時(shí)，不降低機(jī)體的體液免疫功能，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，百令膠囊可降低腎小管對(duì)BUN及血清Cr重吸收，進(jìn)而改善腎功能，其可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及環(huán)孢菌素A抗排異反應(yīng)藥效, 提高大鼠存活時(shí)間及存活率，對(duì)移植腎有一定的保護(hù)作用。但其抑制移植排斥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡是否相關(guān)還有待于進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)研究。

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Effect of Bailing Capsule on renal function and rejection in rats with renal transplantation

ZUO Xia1, GUO Lihong1, LI Li2

(1.Taihe Hospital of Shiyan City, Shiyan 442000, Hubei, China; 2.Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to observe the influence of Bailing Capsule on renal function and rejection in rat with renal transplantation. Methods 80 rats were randomly divided into sham operation group, model group, Cyclosporin A group and Bailing Capsule group, 20 cases in each. The cases in model group, Cyclosporin A group and Bailing Capsule group were performed orthotopic left kidney transplantation. Then the rats in Bailing Capsule group were treated with Bailing Capsule 20 mg/kg gavage and intraperitoneal injection of Cyclosporin A 2.0 mg/ (kg.d) for 3-week, and with injection of Cyclosporin only in Cyclosporin A model group and saline irrigation only in sham operation group. The levels of cystatin C (Cys C), blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (Cr); serum malondialdehyde (MDA), lactate dehydrogenase (LDH) and serum superoxide dismutase (SOD), Immunoglobulin G (IgG), whole blood T lymphocyte, monocyte number were detected, and the rat survival time and survival rate were compared between two groups. Results In Bailing Capsule group, the levels of serum Cys C, BUN, Cr, MDA, LDH and the number of T lymphocyte, monocyte were decreased obviously, and the levels of serum SOD, 1gG were elevated markdely, the rat survival time and survival rate were increased significantly. There were significant differences to compared with the model group and Cyclosporin A group (allP<0.05). Conclusion Bailing Capsule can significantly inhibit lipid peroxidation, increase the activity of SOD, scavenge of MDA after renal transplantation, and enhance immunity and anti rejection drug efficacy of Cyclosporin A, reduce renal transplantation postoperative renal ischemia / reperfusion on renal function damage, promoting the recovery of renal function, improve the rat survival time and survival rate, has a protective effect on the transplanted kidney

rat; Bailing Capsule; renal transplantation; immune regulation; renal function

左霞，女，研究方向?yàn)榕R床藥理及外科護(hù)理。

李莉，E-mail：cdscds1226@126.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.009

R-332

A

1008-8849(2015)12-1279-04

2014-12-08