張俊華,蘇建華,陳玉芳,薛建琴,耿瑜睿

(1. 江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院(金壇市人民醫(yī)院)，江蘇 金壇 213200；2. 江蘇省常州市第四人民醫(yī)院，江蘇 常州 213000)

瑞舒伐他汀對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響

張俊華1,蘇建華1,陳玉芳2,薛建琴1,耿瑜睿1

(1. 江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院(金壇市人民醫(yī)院)，江蘇 金壇 213200；2. 江蘇省常州市第四人民醫(yī)院，江蘇 常州 213000)

目的 觀察瑞舒伐他汀對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響，探討其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。方法 將健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、瑞舒伐他汀組，余假手術(shù)組外，其余2組制作缺血再灌注損傷大鼠模型。分別在腦缺血再灌注后12 h、24 h、72 h取各組大鼠腦組織，檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)及Caspase-3陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組和瑞舒伐他汀組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)和Caspase-3陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均明顯增加(P均<0.01)，瑞舒伐他汀組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)和Caspase-3陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均明顯低于模型組(P均<0.01)；隨缺血再灌注時(shí)間延長，各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)和Caspase-3陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均逐漸減少，組內(nèi)再灌注各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。結(jié)論 瑞舒伐他汀對(duì)腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Caspase-3的表達(dá)、對(duì)抗細(xì)胞凋亡有關(guān)。

瑞舒伐他?。荒X缺血再灌注損傷；神經(jīng)細(xì)胞凋亡；Caspase-3

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，證實(shí)凋亡和壞死共同導(dǎo)致腦缺血再灌注后的神經(jīng)元死亡。缺血后神經(jīng)元死亡分別涉及主動(dòng)和被動(dòng)細(xì)胞死亡機(jī)制，主要表現(xiàn)為壞死和凋亡2種形式。有研究表明，急性缺血性腦損傷后，在梗死的中心區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)壞死，而在半暗帶區(qū)以凋亡為主，這種凋亡是梗死灶擴(kuò)大的關(guān)鍵因素[1]。在腦缺血后程序性細(xì)胞死亡過程中激活了Caspase-3，Caspase-3直接參與了腦缺血再灌注損傷的病理生理過程，導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)蛋白及其他Caspase相關(guān)底物蛋白的裂解，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡[2]。本研究探討了瑞舒伐他汀對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響,旨在為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠(SPF級(jí))54只，體質(zhì)量220～250 g，由東南大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SYXK(蘇)2010-0004。屏障環(huán)境普通顆粒飼料和自來水喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室室溫維持在(21±2) ℃，濕度控制在50%～70%，每天更換墊料。

1.2 主要藥品和試劑 羊抗大鼠Caspase-3多克隆抗體,TUNEL凋亡試劑盒(武漢博士德公司),S-P免疫組化染色試劑盒,DAB顯色試劑盒(福州邁新公司)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 54只Wistar成年大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周，按隨機(jī)化原則分為假手術(shù)組、模型組、瑞舒伐他汀組，每組18只。每組又按再灌注時(shí)間分為再灌注12 h、24 h和72 h 3個(gè)亞組,每組6只。

1.3.2 給藥方法 假手術(shù)組和模型組用0.9%氯化鈉20 mL/kg每天1次灌胃。瑞舒伐他汀組預(yù)先4周給予瑞舒伐他汀(南京正大天晴制藥有限公司國藥準(zhǔn)字)4 mg/(kg·d)每天1次灌胃，再灌注期間繼續(xù)瑞舒伐他汀4 mg/(kg·d)每天1次灌胃。

1.3.3 大鼠腦缺血再灌注模型的建立 大鼠禁食24 h，采用腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥1.6 mL/kg進(jìn)行麻醉。取頸前左旁25 mm的縱向切口，鈍性游離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，結(jié)扎頸外動(dòng)脈(ECA)和同側(cè)CCA近心端，用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)；在CCA結(jié)扎的遠(yuǎn)心端剪一小口并插入A4號(hào)栓塞線，松開動(dòng)脈夾，栓塞線進(jìn)入左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，并延伸到大腦中動(dòng)脈的起始部，然后用縫合線系住栓塞線，確認(rèn)無活動(dòng)性出血后縫合皮膚；在缺血3 h時(shí)將栓塞線拔出10 mm形成再灌注。假手術(shù)組手術(shù)步驟同手術(shù)組，但是術(shù)中不插入栓塞線。制作缺血再灌注損傷大鼠模型后，待每只大鼠麻醉清醒后，立即給予判定。實(shí)驗(yàn)大鼠不能伸展對(duì)側(cè)前爪或者向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈或者向?qū)?cè)傾倒即為成功模型[3]。

1.3.4 大鼠腦組織標(biāo)本取樣及制備 分別在腦缺血再灌注后12 h、24 h、72 h取大鼠腦組織。取樣方法：用3%戊巴比妥1.6 mL/kg對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，開胸經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈并固定，剪開右心耳，先快速灌注100 mL冰生理鹽水，然后灌注400～600 mL 4 ℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液，直至肝臟、四肢發(fā)白和僵硬。斷頭取腦，取左側(cè)大腦頂葉皮質(zhì)置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定后用于細(xì)胞凋亡及免疫組化的檢測(cè)。

1.3.5 觀察指標(biāo)和圖像分析 用TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況；用免疫組織化學(xué)染色方法按S-P試劑盒說明書操作步驟檢測(cè)Caspase-3蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。各組在各時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞凋亡和Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)，每張切片400倍高倍鏡下任取5個(gè)視野分別計(jì)數(shù)相應(yīng)的細(xì)胞凋亡數(shù)和Caspase-3陽性表達(dá)數(shù)，取其平均值。凋亡細(xì)胞呈棕褐色或棕黃色，顆粒深染，胞核固縮；Caspase-3陽性表達(dá)時(shí)胞質(zhì)和/或核著色為棕黃色。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 見表1。

表1 各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)比較個(gè))

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.01;②與模型組比較，P<0.01；③與再灌注12 h比較，P<0.01；④與再灌注24 h比較，P<0.01。

2.2 Caspase-3蛋白陽性表達(dá)情況 再灌注 12 h、24 h、72 h，模型組和瑞舒伐他汀組Caspase-3蛋白陽性數(shù)均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.01)，瑞舒伐他汀組明顯低于模型組(P均<0.01);隨缺血再灌注時(shí)間延長,各組Caspase-3蛋白陽性數(shù)均逐漸減少，組內(nèi)再灌注各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。見表2及圖1～9。

表2 各組Caspase-3蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比較個(gè))

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.01;②與模型組比較，P<0.01；③與再灌注12 h比較，P<0.01；④與再灌注24 h比較，P<0.01。

圖1 假手術(shù)組12 h Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)情況(×400)

圖2 假手術(shù)組24 h Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)情況(×400)

3 討 論

細(xì)胞凋亡與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)，在腦缺血再灌注損傷的病理生理過程中，細(xì)胞凋亡及多種基因表達(dá)的改變和互相調(diào)控起重要作用[4]，腦損傷范圍的大小與神經(jīng)凋亡細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)[5]。凋亡存在2種主要的相互關(guān)聯(lián)途徑，即內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)和外源性途徑(細(xì)胞表面死亡受體途徑)。目前已發(fā)現(xiàn)14種Caspase蛋白[6]，Caspase家族中的某些成員具有重要的調(diào)控和效應(yīng)作用，參與了凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)，Caspase-3作為其中一個(gè)重要成員，其表達(dá)和活化水平的異常升高則是啟動(dòng)凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。正常狀態(tài)的腦細(xì)胞中，存在無活性的以休眠狀態(tài)的酶原形式存在的Caspase-3，以上2條途徑可將其激活。PARP、actin、fodrin、lamin等不同底物被活化的Caspase-3切割，從而導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)放大，最終使細(xì)胞走向凋亡[8]?；罨腃aspase-3通過水解特異性蛋白，一方面直接導(dǎo)致凋亡，另一方面破壞細(xì)胞骨架蛋白及其調(diào)節(jié)蛋白、參與DNA修復(fù)的酶等，抑制修復(fù)DNA，協(xié)助完成凋亡的過程。在腦組織缺血、損傷的凋亡過程中，可檢測(cè)到活性增強(qiáng)的Caspase-3蛋白因子[9]。

圖3 假手術(shù)組72 h Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)情況(×400)

圖4 模型組12 h Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)情況(×400)

圖5 模型組24 h Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)情況(×400)

圖6 模型組72 h Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)情況(×400)

圖7 瑞舒伐他汀組12 h Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)情況(×400)

圖8 瑞舒伐他汀組24 h Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)情況(×400)

圖9 瑞舒伐他汀組72 h Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)情況(×400)

Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，多種因素促使Caspase-3的激活和釋放，在凋亡過程中起著最后的樞紐作用。范磊等[10]研究報(bào)道，去除Caspase-3基因的大鼠和正常大鼠相比，腦缺血2 h再灌注48 h后，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)降低了36%，梗死體積下降了55%，這說明Caspase-3在腦缺血再灌注細(xì)胞損傷中發(fā)揮了重要作用。在腦組織缺氧缺血過程中及缺血再灌注損傷中，應(yīng)用Caspase-3抑制劑可使腦缺血后神經(jīng)元凋亡的數(shù)量明顯減少，腦缺血病灶范圍縮小，從而有效地保護(hù)腦細(xì)胞。以上研究結(jié)果說明Caspase-3參與了腦缺血性損傷，促進(jìn)了神經(jīng)元的凋亡，在神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA) 還原酶抑制劑[11]，可能通過多種途徑、多種機(jī)制發(fā)揮抗氧化作用，從而挽救缺血半暗帶，保護(hù)缺血腦細(xì)胞[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組和瑞舒伐他汀組缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)及Caspase-3蛋白陽性表達(dá)數(shù)均明顯高于假手術(shù)組，再灌注12 h達(dá)高峰，然后逐漸下降。與模型組比較，瑞舒伐他汀組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)及Caspase-3蛋白陽性表達(dá)數(shù)明顯降低?？梢?，腦缺血再灌注損傷引起了神經(jīng)細(xì)胞凋亡和Caspase-3陽性表達(dá)的增加，但是用瑞舒伐他汀預(yù)處理能減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡和Caspase-3的表達(dá)，從而減輕腦缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡是造成再灌注損傷的主要因素之一，改善腦缺血再灌注損傷的有效方法是阻斷再灌注后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀對(duì)腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Caspase-3表達(dá)、對(duì)抗細(xì)胞凋亡有關(guān)，本研究為臨床應(yīng)用瑞舒伐他汀治療缺血性卒中提供了理論依據(jù)。

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Effects of Rosuvastatin on neural cell apoptosis and Caspase-3 expression of rats with cerebral ischemia reperfusion injury

ZHANG Junhua1, SU Jianhua1, CHEN Yufang2, XUE Jianqin1, GENG Yurui1

(1. Affiliated Jintan Hospital of Jiangsu University, Jintan 213200, Jiangsu, China; 2. The Forth People’s Hospital of Changzhou, Changzhou 213000, Jiangsu, China)

Objective It is to observe the influence of rosuvastatin on nerve cell apoptosis and Caspase-3 expression of rats with cerebral ischemia reperfusion injury, and investigate the mechanism of neuroprotection. Methods The healthy male Wistar rats were randomly divided into sham operation group, model group and rosuvastatin group, the ischemia reperfusion injury rat model were made in model group and rosuvastatin group respectively. The brain tissue of rats were obtain after cerebral ischemia-reperfusion in 12 h, 24 h, and 72 h, and then the number of the apoptosis of neural cells and Caspase-3 positive cells were measured. Results Compared with the sham operation group, the number of nerve cell apoptosis and Caspase-3 positive cells of the model group and rosuvastatin group were increased significantly (P<0.01). Compared with the model group, rosuvastatin significantly reduced the number of Caspase-3 positive cells, there is significant statistically significant difference (P<0.01). Conclusion Rosuvastatin on cerebral ischemia reperfusion injury has neuroprotective effect, and the mechanism may be associated with the down-regulation of Caspase-3 expression, against cell apoptosis.

Rosuvastatin; cerebral ischemia reperfusion injury; neuronal apoptosis; Caspase-3

張俊華，男，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科臨床和科研工作。

蘇建華，E-mail:sjh2385225@163.com

金壇市科學(xué)技術(shù)局計(jì)劃項(xiàng)目(JT2013064)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.002

R-332

A

1008-8849(2015)12-1257-04

2014-12-02