李鳳霞，徐 萍，葉 青，曹小燕，鄭建國(guó)，張育紅，付 坤

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎應(yīng)用來(lái)氟米特的時(shí)間治療學(xué)研究

李鳳霞，徐 萍，葉 青，曹小燕，鄭建國(guó)，張育紅，付 坤

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

目的 探討來(lái)氟米特(LEF)不同給藥時(shí)間對(duì)大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的治療效果和對(duì)炎性細(xì)胞因子的影響。方法 取6只大鼠作為空白組，其余造模后第15天加強(qiáng)免疫后關(guān)節(jié)炎指數(shù)>5的24只成模大鼠隨機(jī)分為模型組、LEF7時(shí)組、LEF19時(shí)組，每組8只。LEF7時(shí)組于7:00、LEF19時(shí)組于19:00分別灌胃LEF5mg/(kg·d)，模型組及空白組分別給予等量生理鹽水，均灌胃28d。對(duì)比觀(guān)察各組膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型炎癥評(píng)分、外周血腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平及骨質(zhì)破壞情況。結(jié)果 給藥后LEF7時(shí)組、LEF19時(shí)組關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹度均明顯低于給藥前及模型組(P均<0.05)，LEF19時(shí)組有高于LEF7時(shí)組趨勢(shì)，但2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LEF7時(shí)組、LEF19時(shí)組外周血TNF-α、IL-6水平均低于模型組(P均<0.05);LEF19時(shí)組TNF-α和IL-6水平有高于LEF7時(shí)組的趨勢(shì)，但2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。各組膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)均出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)破壞，且模型組骨質(zhì)破壞更明顯。結(jié)論LEF不同時(shí)間給藥對(duì)大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎及其炎性細(xì)胞因子的影響可能存在差異，且可能延緩骨質(zhì)破壞。

膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎;來(lái)氟米特;時(shí)間治療學(xué);SD大鼠

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因未明的多系統(tǒng)性自身免疫性疾病，晨僵是其特征性表現(xiàn)之一[1]。近年來(lái)有報(bào)道采用時(shí)間治療學(xué)給予潑尼松治療RA比傳統(tǒng)的給藥方式更有效[2-3]。來(lái)氟米特(LEF)作為重要的改變病情抗風(fēng)濕藥(disease-modifying antirheumatic drug，DMARD)之一，使用越來(lái)越廣泛，它能有效控制炎癥，為大量RA患者帶來(lái)福音。但是LEF作為治療RA的一線(xiàn)改變病情抗風(fēng)濕藥尚缺乏在時(shí)間治療學(xué)方面的研究。RA患者血液中炎癥細(xì)胞因子存在晝夜時(shí)間節(jié)律，并與晨僵癥狀一致[4-5]。因此認(rèn)為，采用時(shí)間生物學(xué)策略，根據(jù)患者炎性細(xì)胞因子的晝夜節(jié)律時(shí)間給藥可能比傳統(tǒng)臨床給藥治療效果更佳。最先的動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)具有與RA患者相似的病理、免疫學(xué)、遺傳學(xué)和炎性細(xì)胞因子特征[6-7]。因此，本研究在建立大鼠CIA模型的基礎(chǔ)上，觀(guān)察了不同時(shí)間應(yīng)用 LEF對(duì)CIA模型炎癥評(píng)分及血清腫瘤壞死因子-α( TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、關(guān)節(jié)影像學(xué)的影響，旨在探討LEF是否存在時(shí)間治療學(xué)效應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠50只，雌雄各半，清潔級(jí)，體質(zhì)量(160±20)g，毛色純白，購(gòu)自湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2011-008；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(鄂)2011-0031。 將大鼠放置時(shí)間生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，固定光照(L)∶黑暗(D)時(shí)間(12∶12，明期7:00—19:00，暗期19:00—7:00，室溫(21±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，自由食水，適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料 牛Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑(美國(guó)Sigma公司)；LEF，由蘇州-長(zhǎng)征欣凱公司惠贈(zèng)；大鼠血清TNF-α、IL-6試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。主要儀器:手持式勻漿器(德國(guó)FLUKO)，Wellscan MK3酶標(biāo)儀(芬蘭)，超低溫冰箱(中國(guó)海爾)，游標(biāo)卡尺(中國(guó))。

1.3 CIA大鼠模型的建立

1.3.1 免疫混合物的制備 將牛Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑4 ℃冰箱過(guò)夜，將二者按1∶1體積比例混合，使用手持勻漿器5 000 r/min充分乳化，制成含牛Ⅱ型膠原1 mg/mL的完全弗氏佐劑(FCA)乳化液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 模型復(fù)制 采用游標(biāo)卡尺檢測(cè)大鼠雙后足踝關(guān)節(jié)直徑后，取6只作為空白組外，其余均于尾根部常規(guī)皮膚消毒，用微量注射器皮內(nèi)注射FCA 0.2 mL/只；14 d后加強(qiáng)免疫，于尾根部不同部位皮內(nèi)注射FCA 0.1 mL/只?？瞻捉M大鼠給予同等劑量的生理鹽水皮內(nèi)注射，方法同上。

1.4 分組與實(shí)驗(yàn)步驟 造模后第15天，將加強(qiáng)免疫后關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)>5的24只成模大鼠隨機(jī)分為模型組、LEF7時(shí)組、LEF19時(shí)組，每組8只。LEF7時(shí)組于7:00、LEF19時(shí)組于19:00分別灌胃LEF 5 mg/(kg·d)，模型組及空白組分別給予等量生理鹽水，均灌胃28 d。給藥前后測(cè)定大鼠后足踝關(guān)節(jié)腫脹度、AI和大鼠關(guān)節(jié)攝片。末次給藥后，于次日8:00將大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100g) 腹腔注射麻醉后，經(jīng)股動(dòng)脈采血，分離血清備檢。

1.5 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度和AI評(píng)定 采用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠后足踝關(guān)節(jié)腫脹度:大鼠固定器固定大鼠后，將待測(cè)后肢以脛骨下端內(nèi)踝處為解剖標(biāo)志點(diǎn)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量右后踝關(guān)節(jié)左右直徑。AI評(píng)定按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)：0分為無(wú)紅腫；1分為有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹;2分為關(guān)節(jié)中度腫脹；3分為關(guān)節(jié)重度腫脹；4分為關(guān)節(jié)強(qiáng)直甚至畸形，嚴(yán)重功能障礙。每爪4分,共計(jì)16分,6～8分為嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎。AI=四肢關(guān)節(jié)評(píng)分之和。

1.6 關(guān)節(jié)影像學(xué)評(píng)定 每只大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g) 腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，將四肢伸展固定，留取X射線(xiàn)影像學(xué)資料，觀(guān)察關(guān)節(jié)破壞情況。于初次免疫前、初次給藥前、末次給藥后留取大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)資料，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀(guān)察和組間比較。影像學(xué)破壞分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期:無(wú)破壞性改變，可見(jiàn)骨質(zhì)疏松；Ⅱ期:骨質(zhì)疏松，可有輕度的軟骨破壞，有或沒(méi)有輕度的軟骨下骨質(zhì)破壞，可見(jiàn)關(guān)節(jié)活動(dòng)受限,但無(wú)關(guān)節(jié)畸形；Ⅲ期:骨質(zhì)疏松加軟骨或骨質(zhì)破壞，關(guān)節(jié)畸形，如半脫位、尺側(cè)偏斜，無(wú)纖維性或骨性強(qiáng)直；Ⅳ期:纖維性或骨性強(qiáng)直。

1.7 血清TNF-α、IL-6的檢測(cè) 采用ELISA法測(cè)定，嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行操作:取出試劑盒，各試劑平衡至室溫(20～25 ℃)。取出酶標(biāo)板，按次序分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測(cè)樣品100 μL于空白微孔中，空白對(duì)照加入100 μL樣品稀釋液。37 ℃孵育90 min，棄液、甩干。在各孔中加入100 μL酶標(biāo)記溶液(不含空白對(duì)照孔)，將酶標(biāo)板密封，37 ℃避光孵育60 min，洗板3次，用吸水紙拍干。各孔加入100 μL ABC工作液，37 ℃避光孵育30 min，洗板5次，用吸水紙拍干。各孔加入底物溶液90 μL。37 ℃下避光孵育10～15 min。每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。根據(jù)OD值，由酶標(biāo)儀編程直接得出濃度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠足腫脹度及AI比較 給藥給藥28 d后,LEF7時(shí)組、LEF19時(shí)組AI、關(guān)節(jié)腫脹度均明顯低于給藥前及模型組(P均<0.05)，LEF19時(shí)組有高于LEF7時(shí)組趨勢(shì)，但2組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠足腫脹度及AI比較

注:①與給藥前比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 模型組血清TNF-α、IL-6水平均高于空白組(P均<0.05);LEF7時(shí)組、LEF19時(shí)組外周血TNF-α、IL-6水平均低于模型組(P均<0.05);LEF19時(shí)組TNF-α和IL-6水平有高于LEF7時(shí)組的趨勢(shì)，但2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)表現(xiàn) 除空白組外，其余組大鼠關(guān)節(jié)均出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)破壞，給藥28 d后模型組關(guān)節(jié)破壞較LEF7時(shí)組、LEF19時(shí)組更明顯。見(jiàn)圖1。

3 討 論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)RA的發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)和藥物治療的時(shí)間生物學(xué)研究表明，晝夜節(jié)律在 RA的疾病過(guò)程中起著重要作用，對(duì)指導(dǎo)臨床醫(yī)生轉(zhuǎn)變RA的治療策略產(chǎn)生重要影響。雖然LEF目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療RA，但仍有部分患者療效欠佳或因LEF不良反應(yīng)停藥，猜測(cè)可能與未合理服用LEF有關(guān)，如劑量不足或給藥時(shí)間不合理等。

表2 各組大鼠血清細(xì)胞因子水平比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

圖1 各組給藥前后大鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)表現(xiàn)

LEF是一種新型免疫調(diào)節(jié)藥物，口服后經(jīng)腸壁和肝臟迅速轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物A771726,能抑制細(xì)胞黏附和酪酸激酶的活性[8],通過(guò)抑制二氫乳酸脫氫酶的活性,阻斷嘧啶的合成,減少炎癥因子的產(chǎn)生,從而發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用。由于LEF與血漿蛋白結(jié)合，血漿半衰期長(zhǎng)達(dá)15～18 d，因此其給藥間隔時(shí)間、晝夜給藥最佳時(shí)間等的研究對(duì)提高臨床療效和減少毒副作用具有實(shí)際意義。

To等[9-10]先后經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)RA炎性細(xì)胞因子的晝夜節(jié)律給藥，睡前服用甲氨蝶呤(MTX)的時(shí)間療法與常規(guī)用藥法相比可更有效改善RA的臨床癥狀。本研究結(jié)果顯示,采用夜間給藥和晨起給藥2種方式治療大鼠CIA均有效，但7：00給藥和19：00給藥各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅提示7：00給藥療效可能優(yōu)于19：00給藥。大鼠為晝伏夜出的哺乳動(dòng)物，24 h晝夜節(jié)律不同于人類(lèi)，本研究間接提示夜間給藥可能改善人類(lèi)應(yīng)用LEF治療RA療效，這與國(guó)外關(guān)于其他改變病情抗風(fēng)濕藥時(shí)間治療學(xué)研究結(jié)果存在一定相似性。本研究采用大鼠CIA模型，結(jié)果與國(guó)內(nèi)LEF采用時(shí)間治療學(xué)方法治療大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎(AIA)模型研究結(jié)果存在一定差異[11]，推測(cè)可能與給藥時(shí)間點(diǎn)和給藥周期不同有關(guān),同時(shí)CIA和AIA 2種模型根據(jù)晝夜節(jié)律給藥并未獲得如糖皮質(zhì)激素和甲氨蝶呤夜間給藥的更大收益，推測(cè)可能與LEF半衰期長(zhǎng)有關(guān)。

由于本研究未設(shè)計(jì)臨床研究，只能根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)LEF可能存在時(shí)間治療學(xué)效應(yīng)，但要確定LEF治療RA的最佳給藥時(shí)間，尚需進(jìn)一步開(kāi)展針對(duì)臨床試驗(yàn)、更多給藥時(shí)間點(diǎn)的時(shí)間藥效學(xué)、不同給藥間隔時(shí)間、時(shí)間毒理學(xué)以及時(shí)間藥代動(dòng)力學(xué)、滑膜病理學(xué)等相關(guān)研究。

[1] Arnett FC,Edworthy SM,Bloch DA,et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum，1988，31:315-324

[2] Buttgereit F,Doering G,Schaeffler A,et al. Efficacy of modified-release versus standard prednisone to reduce duration of morning stiffness of the joints in rheumatoid arthritis (CAPRA-1):a double-blind, randomised controlled trial[J]. Lancet，2008，371(9608):205-214

[3] Frank B,Gisela D,Achim S,et al. Targeting pathophysiologicalrhythms:prednisone chronotherapy shows sustained efficacy in rheumatoid arthritis[J]. Ann Rheum Dis，2010,69(7):1275-1280

[4] Arvidson NG,Gudbjornsson B,Larsson A,et al. The timing of glucocorticoid administration in rheumatoid arthritis[J]. Ann Rheum Dis，1997，56(1):27-31

[5] Sulli A,Maestroni GJ,Villaggio B,et al. Melatonin serum levels in rheumatoid arthritis[J]. Ann NY Acad Sci，2002，966:276-283

[6] Marinova-Mutafchieva L,Williams RO,Mason LJ,et al. Dynamics of proinflammatory cytokine expression in the joints of mice with collagen-induced arthritis(CIA)[H]. Clin Exp Immunol，1997，107(3):507-512

[7] Mussener A,Litton MJ,Lindroos E,et al. Cytokine production in synovial tissue of mice with collagen-induced arthritis(CIA)[J]. Clin Exp Immunol，1997，107:485-493

[8] Bartlett RR,Brendel S,Zielinski T,et al. Leflunomide,an immunorestoring drug for the therapy of autoimmune disorders,especially rheumatoid arthritis[J]. Transplant Proc,1996,28(6):3074-3078

[9] To H,Irie S,Tomonari M,et al. Therapeutic index of methotrexate depends on circadian cycling of tumour necrosis factor-alpha in collagen-induced arthritic rats and mice[J]. J Pharm Pharmacol,2009,61(10):1333-1338

[10] To H,Yoshimatsu H,Tomonari M,et al. Methotrexate chronotherapy is effective against rheumatoid arthritis[J]. Chronobiol Int，2011,28(3):267-274

[11] 李振彬，張英杰，齊靜，等. 來(lái)氟米特對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的時(shí)間治療學(xué)初步觀(guān)察[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2014，26(3):72-75

Research on leflunomide chronotherapy in treatment of collagen-induced arthritis in rats

LI Fengxia, XU Ping, YE Qing, CAO Xiaoyan, ZHENG Jianguo, ZHANG Yuhong, FU Kun

(The People’s Hospital Affiliated to Hubei Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to investigate the therapeutic effect of leflunomide (LEF) by different administration time in rats with collagen-induced arthritis (CIA) and its influence on inflammatory cytokines. Methods 6 rats were selected into the control group, and the others were used to establish the models of CIA, and 24 successful models were randomly divided into model group, group A and group B with 8 cases in each groups. LEF was given at 07:00 in group A and 19:00 in group B respectively, and equal dose of physiological saline was given in control group and model group. Gastric administration lasted 28 days. Then the changes of inflammation scores, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) levels of peripheral blood in all groups were observed, and the X-ray changes of joints were observed too. Results The arthritis indexes (AI) and joint swelling degree were significantly decreased in the group A and group B after treatment (allP<0.05), and there was significant difference compared with model group (allP<0.05), there was a trend of that in group A was lower than that in group B, but there was no significant difference between group A and group B (allP>0.05). Compared with model group, the levels of TNF-α, IL-6 in peripheral blood were significantly decreased in group A and group B (allP<0.05), there was a trend of that in group A was lower than that in group B, but there was no significant difference between group A and group B (allP>0.05). Bone destruction and loss were observed in all rats of CIA, and the bone destruction in model group was the most obvious. Conclusion The influence of LEF administration at different time on CIA and inflammatory cytokines in rats may be different. LEF may be prevented bone destruction in CIA rats.

collagen-induced arthritis; leflunomide; chronotherapeutics; SD rat

李鳳霞，女，住院醫(yī)師，碩士研究生，主要從事風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病的研究和臨床工作。

徐萍，E-mail:shyxup@sina.com

十堰市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(201320)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.24.004

R-332

A

1008-8849(2015)24-2632-03

2014-05-10