王亞奇，孔垂?jié)?，張哲，畢曉軍，高小?/p>

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110001）

·論著·

人腎上腺腫瘤組織中蛋白激酶Cα和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)及意義

王亞奇，孔垂?jié)?，張哲，畢曉軍，高小?/p>

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110001）

目的探討蛋白激酶Cα（PKCα）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在腎上腺腫瘤、腎上腺增生組織和正常腎上腺組織中的表達(dá)情況和意義。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot和免疫組化技術(shù)對(duì)41例腎上腺腺瘤、25例良性腎上腺增生組織和7例正常腎上腺組織的PKCα和VEGF表達(dá)情況進(jìn)行比較。結(jié)果腎上腺腺瘤中PKCα和VEGF的陽性表達(dá)高于腎上腺增生組織和正常腎上腺組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腎上腺增生組織中PKCα與VEGF的表達(dá)均高于正常腎上腺組織，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論P(yáng)KCα和VEGF可能與腎上腺腫瘤微血管形成、腫瘤增殖有關(guān)，有可能成為診斷標(biāo)志物以及治療的靶點(diǎn)。

腎上腺腫瘤；腎上腺增生；蛋白激酶Cα；血管內(nèi)皮生長因子

目前腎上腺增生及腎上腺腫瘤的發(fā)病機(jī)制及兩者之間是否存在因果關(guān)系還不完全明確。蛋白激酶Cα（protein kinase C α，PKCα）在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過程中起著重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，因而對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義［1～5］。另外，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以參與病理性血管生成，因而成為當(dāng)今抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一［6～8］，有研究提示VEGF在腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤中的表達(dá)高于正常腎上腺組織［9～11］。本研究通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）、Western blot和免疫組化方法檢測PKCα和VEGF在腎上腺腺瘤、腎上腺增生組織及正常腎上腺組織中的表達(dá)差異，分析其與腎上腺增生性疾病的關(guān)系，為進(jìn)一步探索新的治療方法提供試驗(yàn)材料及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集2011年6月至2013年6月間中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科手術(shù)治療切除的腎上腺標(biāo)本73例，包括腎上腺腺瘤41例，良性腎上腺增生25例。腎上腺腫瘤組織及增生組織在術(shù)前均行生化及影像學(xué)檢查輔助診斷，且經(jīng)術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)。患者年齡23～68歲，平均48歲，其中男30例，女36例。另外，將7例腎癌根治術(shù)切除且經(jīng)病理檢查未見異常的腎上腺組織作為正常對(duì)照組。標(biāo)本取材經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并獲取每位患者的知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

PKCα和VEGF引物，購自生工生物公司；β-actin，購自美國GenScript公司；TRIZOL、RNA LA PCR試劑盒及SYBR Primescript RT-PCR試劑盒，購自大連寶生物公司；鼠抗人PKCα多克隆抗體、鼠抗人VEGF多克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體、GAPDH，購自美國Santa Cruz公司；DAB顯色試劑盒，購自中衫金橋公司；K15C型低溫超速離心機(jī)，購自美國Sigma公司；VC50T型超聲粉碎儀，購自美國Sonics&Materials公司；MultiphorⅡ型電泳儀，購自瑞典Pharmacia Biotech公司；Trans-Blot SD型半干轉(zhuǎn)膜，購自美國Bio-rad公司；Roche LightCycler?480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀，購自瑞士羅氏公司；OLYMPUS BH-2型雙目顯微鏡，購自日本OLYMPUS公司。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR

用TRIZOL一步提取法提取總RNA，使用RNA LA PCR試劑盒使用說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以β-actin作為內(nèi)參照。引物序列：PKCα上游為5′-TGCTGACT TTGGGATGTG-3′，下游為5′-TGTTTGTTCTCGCTG GTG-3′；VEGF上游為5′-ATGAACTTTCTGCTGTC TTGG-3′，下游為5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3′；β-actin上游為5′-TGACTTAGTTGCGTTACACC C-3′，下游為5′-CGAAGGCTCATCATTCAAAA-3′。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：50℃30 min，99℃5 min，5℃5 min一個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，之后以94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。用βactin的濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行校正，用2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)量。

1.4 Western blot

每例標(biāo)本取50 mg，在4℃下加入400 μL裂解緩沖液，剪碎、勻漿，4℃12 000 r/min條件下離心45 min，留取上清進(jìn)行蛋白定量，調(diào)定至等蛋白濃度后變性備用。取20 μL樣品（含60 μg蛋白）行SDSPAGE電泳（5%濃縮膠，8%分離膠），電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，0.1%TTBS清洗，一抗室溫孵育過夜，TTBS洗膜，二抗室溫孵育1 h，TTBS清洗，之后顯色，Chemi Imager 5500電泳凝膠成像系統(tǒng)成像，檢測樣品中GAPDH表達(dá)作為內(nèi)參照。

1.5 免疫組化

將切片常規(guī)脫蠟、水化后高溫高壓抗原修復(fù)，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知的PKCα和VEGF表達(dá)陽性的肝癌組織做陽性對(duì)照，以胞質(zhì)呈棕黃色顆粒沉著為染色陽性。根據(jù)染色強(qiáng)度及染色陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行強(qiáng)度分級(jí)。染色強(qiáng)度：基本不染色0分，染色淡黃1分，染色適中2分，深染3分。染色陽性細(xì)胞數(shù)：＜10%為0分，10%～≤25%為1分，＞25%～≤50%為2分，＞50%為3分。將每張切片的2項(xiàng)評(píng)分相加，0～1分為低表達(dá)，≥2分為高表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果

PKCα、VEGF在腎上腺腺瘤、腎上腺增生組織和正常腎上腺組織中的表達(dá)趨勢基本一致，PKCα mRNA在上述3類組織標(biāo)本中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.84±0.267、0.24±0.044、0.21±0.037，VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.288、0.25±0.042、0.19± 0.055。PKCα和VEGF在腎上腺腺瘤組中的表達(dá)明顯高于腎上腺增生組（P＜0.05）和正常腎上腺組（P＜0.05）。雖然PKCα和VEGF在腎上腺增生組中的表達(dá)高于正常腎上腺組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 Western blot檢測結(jié)果

如圖1所示，PKCα在腎上腺腺瘤組中的表達(dá)明顯高于腎上腺增生組和正常腎上腺組。VEGF在腎上腺腺瘤組中的表達(dá)也明顯高于腎上腺增生組和正常腎上腺組。

圖1 Western blot檢測PKCα和VEGF的表達(dá)Fig.1 Expression of PKCα and VEGF of the specimens detected by Western blot

2.3 免疫組化檢測結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果（圖2）提示PKCα和VEGF主要在腎上腺腺瘤的胞質(zhì)中表達(dá)，部分血管內(nèi)皮也可見表達(dá)。在腎上腺腺瘤組、腎上腺增生組中PKCα的陽性表達(dá)率分別為63.14%（26/41）、20.00%（5/ 25），VEGF的陽性表達(dá)率分別為68.29%（28/41）、16.00%（4/25）。PKCα和VEGF在正常腎上腺組織中的表達(dá)基本均為陰性。PKCα和VEGF在腎上腺腺瘤組中的表達(dá)均明顯高于腎上腺增生組（P＜0.05）和正常腎上腺組（P＜0.05）；兩者在腎上腺增生組和正常腎上腺組的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖2 免疫組化檢測PKCα和VEGF的表達(dá)情況×200Fig.2 Expression of PKCα and VEGF of the specimens by immunohistochemistry SP method×200

2.4 腎上腺腺瘤中PKCα與VEGF的表達(dá)水平與關(guān)系

根據(jù)腎上腺腺瘤中細(xì)胞著色程度和百分比，分為PKCα陽性表達(dá)組（26例）和PKCα陰性表達(dá)組（15例）。PKCα陽性表達(dá)組中VEGF的陽性表達(dá)率（84.62%）明顯高于PKCα陰性表達(dá)組（40.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示PKCα表達(dá)水平與VEGF可能有相關(guān)性。見表1。

表1 腎上腺腺瘤組織PKCα表達(dá)與VEGF表達(dá)的關(guān)系Tab.1 Relationship between the expression of PKC α and VEGF in adrenal adenoma tissue

2.5 PKCα和VEGF的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，腎上腺腺瘤組織中PKCα、VEGF在不同年齡組間和不同性別間陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但多發(fā)的腫瘤組織中PKCα和VEGF陽性表達(dá)率均高于單發(fā)的腫瘤組織（P＜0.05），直徑≥4 cm的腫瘤組織中PKCα和VEGF陽性表達(dá)率均高于直徑＜4 cm的腫瘤組織（P＜0.05）。見表2。

3 討論

腎上腺腫瘤是泌尿外科的常見外科腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展的遺傳學(xué)和組織病理學(xué)特點(diǎn)目前仍不清楚。臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，腎上腺最常見的腫瘤是腎上腺腺瘤［12］。

PKC作為機(jī)體信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要因子之一，參與細(xì)胞信息傳遞、分泌、離子通道調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、分化及癌變等一系列過程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，PKC在腎癌［13］、胃癌［14］及乳腺癌［15］等多種組織中表達(dá)明顯高于正常組織。本研究發(fā)現(xiàn)PKCα在腎上腺腺瘤中比在腎上腺增生組織及正常腎上腺組織中表達(dá)量高，提示腎上腺腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中可能會(huì)通過某種途徑激活相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)使得其表達(dá)量增多。

表2 PKCα、VEGF表達(dá)水平與腎上腺腺瘤臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.2 Relationship between the expression of PKCα and VEGF with the histopathology of adrenal adenoma tissue

VEGF在腫瘤血管形成及調(diào)節(jié)新生血管重塑、成熟等方面有著重要的作用，在乳腺癌［16］、胃癌［17］、肺癌［18］等腫瘤組織中新生血管的形成位點(diǎn)，VEGF的表達(dá)增多。曾有研究表明，VEGF在腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤中的表達(dá)比在正常腎上腺組織中高，并且在惡性嗜鉻細(xì)胞瘤中的表達(dá)高于良性嗜鉻細(xì)胞瘤，提示VEGF有可能與嗜鉻細(xì)胞瘤由良性向惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。本研究中VEGF在腎上腺腺瘤中的表達(dá)比在正常腎上腺組織及腎上腺增生組織中的表達(dá)要多，提示VEGF可能參與腎上腺腺瘤發(fā)生過程中的血管通路建立，促進(jìn)腫瘤生長。

本研究提示，在PKCα表達(dá)陽性的腎上腺腺瘤中VEGF表達(dá)也多為陽性，在PKCα表達(dá)陰性的腎上腺腺瘤中VEGF表達(dá)也多為陰性，兩者呈相似的表達(dá)趨勢，提示兩者在腎上腺腺瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在一定程度的協(xié)同作用或關(guān)聯(lián)。

本研究還發(fā)現(xiàn)PKCα和VEGF的陽性表達(dá)率與性別和年齡無明顯相關(guān)，但是與腫瘤大小、腫瘤數(shù)量相關(guān)，提示PKCα和VEGF有可能和腎上腺腫瘤組織的增生活性、生物學(xué)特征有關(guān)，但需要進(jìn)一步研究。本研究因腎上腺惡性腫瘤標(biāo)本相對(duì)缺乏，因而對(duì)腎上腺腫瘤的發(fā)展、惡性化難以有系統(tǒng)完善的闡述，因此需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量并跟蹤研究才能進(jìn)一步明確。

綜上所述，PKCα和VEGF在腎上腺腺瘤組織中的表達(dá)高于腎上腺增生組織及正常腎上腺組織且有顯著差異，提示PKCα和VEGF可能共同參與了腎上腺腺瘤的發(fā)生、發(fā)展，并有可能成為診斷標(biāo)志物以及治療的靶點(diǎn)。PKCα和VEGF在腎上腺增生組織中的表達(dá)均高于正常腎上腺組織但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。鑒于正常腎上腺組織標(biāo)本例數(shù)偏少，仍需要進(jìn)一步探索研究。

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（編輯 陳 姜）

Expression ofProtein Kinase Cαand Vascular EndothelialGrowth Factor in Human AdrenalTumor

WANGYa-qi，KONGChui-ze，ZHANGZhe，BIXiao-jun，GAOXiao-lin

（DepartmentofUrology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

Objective To evaluate the expression ofprotein kinase Cα（PKCα）and vascularendothelialgrowth factor（VEGF）in adrenaltumor，adrenalhyperplasia and normaladrenaltissue，so as to supply a theoreticalbasis forthe diagnosis and treatmentofthese diseases.MethodsTotally 73 specimens of human adrenal gland were collected with clear pathological diagnosis，including 41 cases of adrenal adenoma，25 cases of adrenal hyperplasia，and 7 cases ofnormaladrenalsamples.The expression ofPKCαand VEGF ofthe specimens were determined by real-time PCR，Western blot and immunohistochemistry method.ResultsThe positive expression rates of PKCα and VEGF in adrenal adenoma were both significantly higher than adrenal hyperplasia and normal adrenal.The positive expression rates of PKCα and VEGF in adrenal hyperplasia were slightly higher than normal adrenal tissue；however，the difference between these two groups was not statistically significant.ConclusionThe high expression levels of PKCα and VEGF might be related with the angiogenesis and proliferation of adrenal tumor.PKCα and VEGF could be the new markers for the diagnosisand treatmentofadrenaltumor.

adrenal tumor；adrenal hyperplasia；protein kinase C α；vascular endothelial growth factor

R736.6

A

0258-4646（2015）09-0786-05

國家自然科學(xué)基金（81172438）

王亞奇（1985-），男，醫(yī)師，碩士研究生.

孔垂?jié)桑珽-mail：kongchuize_cmu@sina.cn

2015-04-06

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